伊曲康唑注射液無菌檢查法的建立及方法優化研究

畢榮生

摘? 要：目的：本次試驗的目的在于通過對伊曲康唑注射液無菌檢查法的建立及方法優化研究，選擇出更加適合伊曲康唑注射液無菌控制的檢查方法。方法：本次試驗方法參照《中國藥典》中的無菌檢查法，篩選出伊曲康唑注射液的最優無菌檢查法，選用三種溶液，分別為0.1%的蛋白胨水溶液、pH值為7.0的氯化鈉蛋白胨緩沖液以及0.9%的無菌氯化鈉溶液作為沖洗溶液，應用薄膜過濾法，將多種菌種多為試驗菌進行試驗驗證。通過這種方式形成三種試驗方法，對伊曲康唑注射液進行無菌檢查。結果：通過試驗對比分析，可以看出方法2與方法1雖然沖洗溶液不同，但是檢查效果相同，其中0.1%的蛋白胨水溶液成本要更低。方法3雖然所用沖洗量比較少，但是操作過程比較復雜，沖洗過程中容易出現結晶的情況，不便過濾，綜合對比之后，建議選擇方法1進行伊曲康唑注射液的無菌檢查。結論：選擇方法1進行伊曲康唑注射液的無菌檢查，操作簡單，結果更加準確可靠，值得推廣應用。

關鍵詞：伊曲康唑注射液;無菌檢查法;薄膜過濾法

伊曲康唑注射液是比較常見的一種廣譜抗真菌藥，主要用于各種由致病菌導致的感染疾病的治療。主要是通過抑制真菌細胞膜所需的麥角固醇的合成，破壞真菌細胞膜的形成，最終殺滅真菌。伊曲康唑注射液在治療期間不會對身體其它功能器官造成損傷，治療效果顯著，安全性比較好。伊曲康唑注射液因為是用于真菌感染的治療，因此對伊曲康唑注射液本身的無菌要求比較高，無菌檢查是保證注射液安全無菌的重要途徑。此前雖然已經有過對伊曲康唑注射液的無菌檢查的研究，但是并不明確。本文根據要求，重新對伊曲康唑注射液的無菌檢查方法進行優化研究，用3種不用的稀釋溶液通過薄膜過濾法確定出最有效的無菌檢查法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

WCP-600隔水式培養箱;LRH-250生化培養箱;HTY-2000封閉式集菌儀;HFsafe-760s型生物安全柜;KSF220集菌培養器。

1.2 菌種、樣品

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌。以上菌種均購自中國醫學菌種保藏中心，試驗用菌株均為第2代。樣品為規格為25mL：0.25g的伊曲康唑注射液。

1.3 沖洗液與培養基

pH值為7.0的氯化鈉蛋白胨緩沖液，0.1%的蛋白胨水溶液，0.9%的無菌氯化鈉溶液，營養肉湯培養基，硫乙醇酸鹽流體培養基，改良馬丁培養基，以上培養基適用性檢查均符合《中國藥典》2010年版二部附錄要求。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，35℃培養24h;接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，35℃培養24h;接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，25℃培養48h，上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數小于100CFU的菌懸液。接種黑曲霉菌至改良馬丁瓊脂斜面，25℃培養7d，用0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫孢子，制成每1ml含孢子數小于100CFU的孢子懸液。結果見表1。

2.2 供試液制備

取伊曲康唑注射液樣晶，去除外包裝，以無菌操作方法消毒處理備用，接種每種培養基的檢驗數量為20支，檢驗量為12.5ml。

2.3 驗證方法

2.3.1 試驗管

試驗管中取供試液，采用薄膜過濾法，用0.1%蛋白胨水溶液為沖洗液：沖洗500mL/膜，100mL次作為方法1;pH7.0氯化鈉蛋：白胨緩沖液為沖洗液沖洗500mL/膜，100mL/次作為方法2;每支伊曲康唑注射液以50mL0.9%無菌氣化鈉溶液稀釋，薄膜過濾，再以0.9%無菌氯化鈉溶液為沖洗液，沖洗500mL/膜，100mlL/次作為方法3，進行處理過濾試驗，最后一次沖洗液中加入少于100CFU的試驗菌。過濾后每個培養管內灌注培養基，培養觀察5d。硫乙醇酸鹽流體培養基置30-35℃培養，改良馬丁培養基置23～28℃培養，觀察5d，結果見表2。

2.3.2 對照管

不加入供試液，按2.3.1試驗管方法，同法試驗，結果見表2。

2.4 判斷方法

以上三種方法全都進行三次的平行試驗，將供試品管中的試驗菌與對照管中的試驗菌進行比較，如果供試品管中的試驗菌生長情況良好，那么就說明供試品在這種檢驗條件下的抑菌控制作用并不明顯，可以對照該檢查方法和條件進行無菌檢查。反之，如果試驗品中任何一個容器中的試驗菌生長情況出現問題，生長緩慢或者不生長，就說明這種檢驗方式具有一定的抑菌作用，需要先將抑菌性去除，然后再進行重新驗證，直至無抑菌作用，再進行無菌檢查。

2.5 結果

本文所采用的三種試驗方法，與對照管進行比對之后，可以看出試驗菌中的菌種生長情況全部良好，檢驗驗證通過，伊曲康唑注射液可以采用這三種方法進行無菌檢查。方法1與方法2中所選用的沖洗溶液不同，但是試驗效果相同，其中方法1中使用的0.1%蛋白胨水溶液成本相對更低。方法3雖然配制過程更相似，沖洗液用量也比較少，但是操作過程復雜，溶液容易出現結晶的情況，不容易過濾。根據對比分析結果來看，方法1更適用于伊曲康唑注射液的無菌檢查。

3 討論

本次試驗所采用的0.1%蛋白胨水溶液，pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液以及0.9%無菌氯化鈉溶液都可以用來作為沖洗溶液進行藥品的無菌檢測，但是作用的機制各不相同。其中0.1%蛋白胨水溶液中的蛋白胨營養物質豐富，利于微生物的生長和恢復;pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液除了含有與0.1%蛋白胨水溶液相同質量的蛋白胨之外，還有磷酸二氫鉀以及氯化鈉等多種無機鹽，主要功能是用來維持細胞結構的組成、能量轉移以及代謝的平衡，因為PH值比較穩定，營養物質豐富，有利于微生物的生長;0.9%無菌氯化鈉溶液可以保證細胞中的滲透壓穩定，避免細胞破裂。從沖洗效果來看，pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液的沖洗效果最好，但是成本也比較高，在使用方法1與方法2進行試驗時，薄膜過濾之前不需要進行潤膜這一環節，0.1%蛋白胨完全能夠滿足試驗需求。方法3模擬了注射液在輸液之前的配制程序，但是在過濾的時候發現有結晶產生，薄膜被堵塞，管中的壓力上升，薄膜破損風險大，如果要用這一種方法進行無菌檢查，必須要保證溶液能夠充分稀釋，過濾前后薄膜確保完好。方法1與方法2進行沖洗試驗時，對白色念珠菌和黑曲霉菌等試驗菌的抑菌性去除最低沖洗量分別為500mL/膜和100mL/次，對其它試驗菌并沒有發現抑菌性的產生，可以進行下一步的無菌優化試驗。

參考文獻

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