牛血清白蛋白與二苯酮-4 相互作用的熒光法研究

陳開意，何文妮，邵 波

（浙江樹人大學生物與環境工程學院，浙江 杭州 310011）

近年來，防曬化妝品的使用日益增長，這使得防曬劑中的主要成分有機紫外防曬劑逐漸成為了一種新型環境污染物，其環境污染問題在各國普遍存在[1]。有健康研究表明，部分有機紫外防曬劑對內分泌系統有干擾作用，并且會危害人體和生物體的生殖系統和遺傳系統，不利于胚胎的發育以及出生后的發育，非但如此，還會對人類身體健康造成潛在危害并對周邊生態環境造成污染[2]305。 因此，有機紫外防曬劑被大家認定為一種新的內分泌干擾物質[3-4]。 有機紫外防曬劑是指能夠吸收長波紫外線和中波紫外線的一類有機化合物，這些紫外線會曬黑甚至曬傷我們的皮膚[5]。 紫外線防曬劑的分子都包含可以吸收波長小于400 nm 的紫外線的發色團，發色團為了實現紫外線屏蔽功能通過吸收紫外線并將其轉換為熱能、化學能或者其他非紫外線能。 紫外防曬劑的品種較多，在各種類型的有機紫外防曬劑中，二苯甲酮類防曬劑擁有良好的性能，價格便宜且應用范圍廣，在紫外防曬劑中占據著重要的地位[6]。 由于有機紫外防曬劑的廣泛使用，因此在使用過程中會通過各種方式進入環境。 另外，大多數有機紫外防曬劑都可以溶解在非極性溶劑中，殘留在環境中周期長，不易被降解。 有機紫外防曬劑有2 種方式進入環境，分為直接方式和間接方式。 其中，直接方式包括通過廢水排放防曬劑，將有機紫外防曬劑帶入水生生態系統中；而間接方式包括通過每天洗滌、游泳和沐浴等途徑帶入水中。它們可以滲入皮膚或通過食物鏈進入人類身體。 Janjua 等人經過大量研究發現有機紫外防曬劑二苯酮-3（BP-3）和4- 甲基芐亞甲基樟腦可以通過皮膚進入人體內，并計算出了人體血漿中含有的最大質量濃度分別為0.238 mg/L 和0.018 mg/L[7]。

有研究表明，有機紫外防曬劑有較高毒性，而且有機紫外防曬劑通常都含有不飽和鏈和苯環，導致其殘留在環境中難以降解，容易對環境造成持續影響。目前，有機紫外防曬劑存在于多種環境介質中，例如大氣生態系統、土壤生態系統和水生生態系統等等。 Vila 等人經過檢測得出二苯酮-4（BP-4）容易對藻類造成風險，而BP-3 和甲氧基肉桂酸乙基己酯（EHMC）則更容易對魚類造成危害[8]。 另外，人體內也被不斷檢測出存在有機紫外防曬劑，證實了有機紫外防曬劑能通過食物鏈的富集最終進入人體和動植物體內。 已有報道指出，有機紫外防曬劑對人體和動物體的內分泌系統、生殖發育系統、遺傳系統和神經系統等都有不同程度的不良影響。

通過對BP-4 作用于牛血清白蛋白（BSA）時的作用機理的研究，可以了解在生物體內BSA 與BP-4 之間的結合作用，而且對于現在的環境狀況來說，有機紫外防曬劑與BSA 之間的相互作用的結果可以為環境污染的治理提供參考。

血清白蛋白是一種常用的載體蛋白，它在人體內的血液循環系統中起到貯存和運輸物質的重要作用。將BSA 作為研究對象，探究其與內源或外源性物質相互聯結而發生作用后的影響機理已成為生命科學、環境科學和臨床醫學研究的重要方向。BSA 是牛血漿中含量最豐富的載體蛋白，它具備廣泛的結合能力，同時具有很強的內源性熒光。 外源性化合物與蛋白質分子相互感化會導致蛋白質的內源性熒光強度下降，這就說明其發生熒光猝滅[9]。 目前熒光光譜法已成為研究某些物質作用于血清白蛋白時的分子機理和作用程度的有效方法。 敖俊杰等人通過熒光分光光度法研究了3 種常見的有機紫外防曬劑與BSA 的相互作用的作用機理[2]308。

本實驗通過研究BP-4 與BSA 相互作用來間接驗證其對人體的影響。 本文利用熒光分光光度法來探求BP-4 與BSA 相互作用的機理，了解二者相互作用的猝滅機理。 根據測定的數據來繪制熒光光譜圖，分析結果可知BP-4 與BSA 相互作用的熒光猝滅規律以及相對應的猝滅常數，BP-4 與BSA 互相作用的作用力類型可以通過計算分析熱力學參數來確定。這有利于讓我們了解其在人體內的分布情況和運輸過程，對于我們認識有機紫外防曬劑的毒性有著非常重大的意義，同時這也有助于推動關于有機紫外防曬劑的生態毒性的研究。

1 實驗部分

1.1 實驗設備與材料

1.1.1 實驗設備

Rf-5301pc 熒光分光光度計，日本日立公司；al-204 型電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司；bcd-216zdjJ 型冰箱，青島海爾有限公司；Dk-8D 型數控超級恒溫槽，上海森信實驗儀器有限公司；paoifio-t-2-20 型純水機，山東博科科學儀器有限公司；phsj-4F 型實驗室pH 計，上海儀電科學有限公司；玻璃棒、容量瓶（100 mL，250 mL）、移液管（1 mL，5 mL）、燒杯（100 mL），上海鉑勒機電設備有限公司。

1.1.2 實驗材料

BSA，BR 級，質量分數98%，上海如吉生物科技有限公司；BP-4，BR 級，質量分數>99%，上海榕柏生物技術有限公司； 三（羥甲基）氨基甲烷（Tris 化學藥品），AR 級，質量分數>99%，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.2.1 BSA 的性質

BSA 是一種乳白色的片狀粉末。它的相對分子質量為104，血清蛋白是血液的主要成分，其相對分子質量是68 000，血清蛋白包含581 個氨基酸，其中帶有的17 個二硫鍵是由35 個半胱氨酸組成，而游離巰基組成第34 個肽鏈，牛血清白蛋白能夠和多種陰、陽離子以及小分子結構的物質結合在一起[10]。 血液中的白蛋白主要有以下幾種作用，維持滲透壓、緩沖pH、承擔載體和營養作用。 在動物細胞無血清培養中，添加白蛋白可起到載體作用和生理和機械保護作用。

1.1.2.2 BP-4 的性質

BP-4 是一種奶白色至黃色的粉末，無氣味。 分子式是C14H12O6S，相對分子質量是308.04，溶解度為0.65，是一種常見的有機紫外防曬劑，屬于水溶性化學防曬劑。 圖1 是其化學結構式。

圖1 BP-4 化學結構式

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配置

量濃度為1×10－5mol/L BSA 標準儲備液體：用電子天平稱取0.068 g 的BSA，用超純水溶解在燒杯中，移入100 mL 的容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻，放置于溫度為4 ℃冰箱中進行保存。

量濃度為1×10-4mol/L BP-4 標準溶液：用電子天平準確稱取0.003 1 g 的BP-4，溶于少量超純水中，移入100 mL 容量瓶中，用超純水稀釋至刻度并搖勻，放置于溫度為4 ℃冰箱中進行保存。

量濃度為0.2 mol/ L Tris-HCl 緩沖溶液：準確稱取24.228 g 的Tris 藥品倒入1 L 的大燒杯中，溶于超純水中，將超純水加至約700 mL，用濃HCl 調節pH至7.40±0.05，然后移入容量瓶中，用1 000 mL 超純水定容稀釋，搖勻，放置于室溫下進行保存。

1.2.2 熒光猝滅實驗

在10 mL 比色管中分別加入2 mL Tris-HCl 緩沖液、5 mL 的BSA 標準儲備溶液以及適量的BP-4標準溶液，用超純水定容并搖勻，使BP-4 的最終量濃度分別為0、0.9×10-6、1.8×10-6、2.7×10-6、3.6×10-6、4.5×10-6、6.3×10-6、7.2×10-6和8.1×10-6mol/L。 將上述溶液置于恒溫水槽中，水溫分別調節為300、305和310 K，在恒溫條件下作用0.5 h 至平衡后測定其熒光光譜。 將熒光分光光度計固定激發波長為285 nm，狹縫寬度設置為10 nm，然后測定在250～500 nm 范圍區間內的發射光譜，將熒光強度最大時對應的發射波長記錄下來[11]。

2 結果與討論

2.1 BP-4 與BSA 相互作用的猝滅機理

由于蛋白質大分子具有酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）等小分子結構，所以可以產生較強的內源性熒光。 當蛋白質分子與外源性化合物互相作用時可能會降低蛋白質的內源性熒光強度。300 K 時BP-4 與BSA 相互作用產生的熒光光譜圖如圖2 所示。 其中從B 到J 的藥物量濃度分別為0、0.9×10-6、1.8×10-6、2.7×10-6、3.6×10-6、4.5×10-6、6.3×10-6、7.2×10-6和8.1×10-6mol/L。

圖2 300 K 時BP-4 與BSA 相互作用產生的熒光光譜圖

由圖2 可見，向BSA 中加入BP-4 后，BSA 在340 nm 附近出現熒光峰值。 隨著BP-4 濃度的不斷升高，BSA 的熒光強度有規律地降低，這說明BP-4作用于BSA 時有熒光猝滅作用，引起此處內源性熒光有規律地猝滅。

在普遍情況下，我們將熒光猝滅的過程分為動態猝滅和靜態猝滅2 種類型[12]。在動態猝滅過程中，熒光物質的激發態分子通過與猝滅劑分子的碰撞作用，以能量轉移的機制或電荷轉移的機制喪失其激發能而返回基態。而靜態猝滅從實質上來說是因為熒光體和猝滅劑通過結合形成了基態復合物，這在微觀層面上會影響蛋白質的二級構造，從宏觀層面上影響其生理活性?？梢酝ㄟ^雙分子猝滅速率常數Kq來判斷熒光猝滅類型， 溫度會影響猝滅作用以及熒光光譜的變化。 隨著溫度的不斷上升，由于有效碰撞的離子數不斷增加引起電子遷移的過程加劇屬于動態猝滅；反之如果猝滅常數隨溫度的不斷升高而下降，則屬于靜態猝滅。 這是由于復合物的穩定性隨著溫度的變化而變化。 為了更加深入地證實此猝滅過程的種類，先把它當作動態猝滅來處理，借助斯特恩-沃爾默方程[見式（1）]進行計算[13]：

其中，F0和F 分別是不存在BP-4 時的熒光強度和存在不同濃度BP-4 后的熒光強度；Kq是雙分子猝滅速率常數，單位為L/（mol·s）；τ0是不存在猝滅劑時熒光分子平均壽命，單位為s，通常生物大分子的熒光壽命為10-8s；[Q]為BP-4 的量濃度，mol/L；KSV為動態猝滅常數。 以F0/F 對[Q]進行建模，可以得到線性回歸方程，計算出猝滅速率常數，結果如表1 所示。

表1 BP-4 與BSA 在不同溫度下相互作用的猝滅常數

根據表1 數據可知，猝滅常數隨著溫度的升高而減少，且Kq的數量級大大超過了生物大分子在水溶液中的最大擴散碰撞猝滅常數1 個數量級，這表明BP-4 與BSA 相互作用產生了不具有熒光性的復合物，該過程屬于靜態猝滅。

2.2 BP-4 在BSA 上的結合位點及結合模式分析

從2.1 的結果可知，BP-4 對BSA 的猝滅機理屬于靜態猝滅，因此BP-4 的濃度與熒光強度的關系就符合Lineweaver-Burk 雙導數方程[14]，見公式（2）。

式中：n 是結合位點數；Ka是結合常數，L/mol。

通過lg（[F0-F]/F）對lg[Q]進行擬合，得到線性回歸方程，由此可以分別計算出在不同溫度下BP-4與BSA 相互作用的結合常數、結合位點數，結果見表2。

由表2 數據可見，BP-4 與BSA 二者結合緊密，證明了二者之間劇烈的結合作用，且BP-4 與BSA 之間的結合位點數基本為1，則表明BP-4 與BSA 之間形成1 個結合位點。

表2 BP-4 與BSA 相互作用的結合常數、結合位點數以及相關系數

2.3 BP-4 與BSA 相互作用的熱力學參數與結合力

一般來說，有機小分子與蛋白質等生物大分子相互作用時的作用力主要包括范德華力、疏水作用力和氫鍵結合力等[15-16]。 當溫度變化范圍不大時，可近似把焓變和熵變當做常數，根據范特霍夫方程[見公式（3）]來計算反應的焓變和熵變，再由公式（4）來計算反應的自由能變。

式 中，R 為 標 準 氣 體 常 數：8.314 J/（mol·K）；△H為反應焓變，單位為kJ/mol；△S 為反應熵變，單位為J/（mol·K）；T 為溫度，單位為K；ΔG 為反應的自由能變，單位為kJ/mol。 以結合常數的對數為縱坐標，溫度的倒數為橫坐標進行線性擬合，根據方程的截距和斜率分別計算得△H、△S 及△G 值，結果見表3。

從熱力學基本關系式來看，在溫度和壓力一定的情況下，體系中的ΔG 決定了小分子物質與蛋白質的相互作用能否自發進行，當ΔG＜0 時，該反應可以自發進行。 Ross 等人研究并總結出判斷生物大分子自身相互作用力性質以及生物大分子與小分子物質之間相互作用力的規律，通過比較反應發生前后熱力學焓變ΔH 和熵變ΔS 的相對大小，可以判斷分子間相互作用力類型：如果是典型的疏水作用力，則ΔH＞0，ΔS＞0；如果是氫鍵和范德華力，則ΔH＜0，ΔS＜0；如果是靜電引力，則ΔH＜0，ΔS＞0[17]。

表3 BP-4 與BSA 相互作用的熱力學參數

所得數據可知，ΔG＜0，表明BP-4 可與BSA 自發反應；根據ΔH 和ΔS 判斷，BP-4 主要通過氫鍵和范德華力與BSA 結合[18]。

3 結論

根據分析上述實驗數據，可以得出以下結論：

（1） BP-4 與BSA 相互作用使得其自身的熒光發生明顯猝滅現象，且這種猝滅作用隨BP-4 的濃度升高而增強，可得出該過程屬于靜態猝滅。

（2） BP-4 與BSA 之間的結合位點數為1 左右，表明二者之間存在一種類型的結合位點。

（3） 經過計算BP-4 與BSA 互相作用的熱力學參數，可以知道二者的作用過程是自發進行的，并且BP-4與BSA 之間的相互作用力屬于氫鍵和范德華力。

目前我國有機紫外防曬劑的污染問題日益嚴峻，人們也越來越重視對其毒理性質的研究。本實驗表明BP-4 能在人體中通過BSA 進行轉運和儲存。 目前已有有機紫外防曬劑對水生動物魚類的內分泌干擾的相關研究[19-20]。但是對于人體組織細胞的影響研究還很少，需要進一步深入探索，目前的研究尚不能解釋有機紫外防曬劑和內分泌系統之間的干擾效應。 所以，在未來的研究內容中，我們應該更加進一步去研究有機紫外防曬劑產生的不同內分泌干擾效應的機理。 這樣才能讓我們更加完整科學地認識有機紫外防曬劑對不同生物包括人體健康的各種危害。 這不僅讓我們進一步了解在平時日常生活中如何正確運用防曬劑這類個人護理用品，與此同時也可以為相關部門提供數據方便科學決策。