白花泡桐二四倍體的蛋白質組差異分析

孫華樂，翟曉巧，曹喜兵，鄧敏捷，趙振利，范國強

(1.河南農業大學泡桐研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省林業科學研究院,河南 鄭州 450008)

通過基因組加倍、多倍化在物種形成及植物進化中都起著十分重要的作用。多倍體通常表現出諸多優良性狀，如生物量增加、抗逆性增強、對病蟲害抗性增強等，這些優良性狀在植物育種中具有重要意義[1]。白花泡桐[Paulowniafortunei(Seem.) Hemsl.]為泡桐科泡桐屬植物，原產于中國，是重要的庭院綠化、速生用材以及防護樹種，具有重要的生態意義和經濟價值，在世界范圍內廣泛種植[2]。范國強等[3]用二倍體白花泡桐葉片，利用秋水仙素成功誘導出其同源四倍體，擴大了泡桐的種質資源。與二倍體相比，白花泡桐四倍體具有更優良的光合特性和更強的抗逆性[4-5]。然而，目前四倍體優良性狀在蛋白質水平的分子機制尚不清楚，有關白花泡桐二四倍體間的蛋白質組變化仍有待探討。

文中利用同位素標記相對定量和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技術對白花泡桐二四倍體的蛋白質組進行定量研究，分析兩者之間蛋白質表達水平的差異，并對差異表達蛋白質進行功能注釋，結合轉錄組分析篩選與四倍體形成特異蛋白質，為進一步了解四倍體泡桐優良特性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗材料來源于河南農業大學泡桐研究所培養的二倍體及其同源四倍體白花泡桐，培養溫度為(25±2)℃，光照強度為130 μmol·m-2·s-1，光照時間為16 h·d-1。分別剪取上述兩種培養30 d，長約1.5 cm，長勢一致的組培苗頂芽，用液氮冷凍后迅速置于-80℃冰箱內。樣品標記為：二倍體白花泡桐(B2、B2_1)；四倍體白花泡桐(B4、B4_1)。每個樣品各兩個生物學重復。

1.2 蛋白質提取、iTRAQ標記與預分離

使用丙酮沉淀法提取蛋白質，分別從B2和B4兩種樣品中提取100 μg蛋白質并用iTRAQ試劑標記獲得肽段，根據QIAOetal[6]使用的方法將蛋白質消化并用iTRAQ技術標記，將標記后的各組肽段依次進行混合、分離、除鹽和抽干。具體操作步驟詳見文獻[7]。

1.3 肽段分離與液相串聯質譜分析

將抽干得到的組分用緩沖液A(5%乙腈，0.1%甲酸)重懸,用液相色譜儀(型號LC-20 AD，日本京都島津)和分離柱對樣品進行分離,分離后傳輸至AB SCIEX Triple TOF 5600 質譜系統(美國)，動態參數設置詳見文獻[8]。

1.4 蛋白質鑒定與定量分析

使用Mascot 2.3.02軟件進行蛋白質的鑒定，數據庫來源于白花泡桐轉錄組數據，相關測序數據已上傳到美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)的序列片段歸檔數據庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/sra, SRA)，登錄號為SRP032166[9]。對鑒定到的蛋白質在基因本體論(gene ontology，GO)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數據庫中進行功能注釋。蛋白質的差異標準為差異倍數>1.2或<0.83，且P<0.05。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應驗證

采用植物總RNA提取試劑盒提取B2和B4中的總RNA。隨機挑選8個差異表達的蛋白質，用Taq SYBRGreen qPCR Premix試劑進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time-polymerase chain reaction，qRT-PCR)，在美國伯樂公司的CFX96TM Real-TimeSystem熒光定量聚合酶鏈式反應檢測系統上完成。參照DONGetal[10]方法進行PCR擴增，每個樣品3次重復。使用18 S rRNA作為內參，數據統計采用2-△△Ct法。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR分析所用的引物

2 結果與分析

2.1 蛋白質的鑒定與功能分析

為了解白花泡桐二四倍體蛋白質組的整體信息，對提取的蛋白質進行質量檢測。兩個樣品蛋白質含量符合試驗要求(表2)。共鑒定到458 154個圖譜，Mascot搜庫后，匹配到6 757個圖譜，6 424個特有圖譜，肽段和特有肽段分別為1 229個和1 199個，最終鑒定到696個蛋白質[(圖1(a)]，這些蛋白質的相對分子質量主要集中在10～60 ku，其中占較大比例的范圍為10～20 ku[(圖1(b)]，肽段長度主要集中在7～15個氨基酸[(圖1(c)]，肽段序列覆蓋度在5%～10%的蛋白質占比最多[(圖1(d)]。

表2 白花泡桐蛋白質信息

注:圖1(d)中括號內的數字代表肽段序列覆蓋在每個區間中蛋白質的數量。Note：the numbers in brackets in figure 1 (d) represent the number of proteins in each interval covered by the peptide sequence.

2.2 差異蛋白質分析

為進一步了解四倍體優良特性相關的特異蛋白質，對B2和B4兩樣本鑒定到的總蛋白質進行差異分析。結果共鑒定到75個差異表達的蛋白質，其中，39個上調，36個下調。GO富集分析結果顯示，顯著性富集的GO條目有40個：細胞組分主要條目有胞漿、液泡、核糖體[圖2(a)]；生物進程主要條目有非生物刺激響應、前體代謝物和能量的產生、滲透脅迫響應[圖2(b)]；分子功能主要條目有銅離子結合、果糖二磷酸醛縮酶活性、醛裂合酶活性[圖2(c)]。KEGG通路富集分析參與了35條代謝通路，主要包括代謝途徑(29，48.33%)、糖酵解/糖異生(7，11.67%)、次生代謝產物的生物合成(17，28.33%)、光合生物的碳固定(8，13.33%)和氧化磷酸化(5，8.33%)等(表3)。

圖2 差異表達蛋白質的基因本體論功能注釋分類

表3 差異表達蛋白質的KEGG代謝通路分析

2.3 蛋白質組與轉錄組關聯分析

為了篩選與倍性相關的差異蛋白質，把上述得到的蛋白質數據與白花泡桐轉錄組數據進行關聯分析。結果顯示，總蛋白質關聯到18 984個基因，其中75個差異蛋白質關聯到1 158個基因,在75個差異蛋白質中，有65個對應的基因在轉錄水平上變化不明顯；有37個不差異的蛋白質，但其對應的基因在轉錄水平差異表達。在關聯到的9個差異蛋白質中，有7個蛋白質變化趨勢與其對應基因的變化趨勢一致，這7個蛋白質中有4個注釋到KEGG數據庫中，分別是鎂螯合酶H亞基(m.55631)、V型H+轉運ATPase亞基A(m.33869)、細胞色素C氧化酶亞基5b(m.12004)和果糖二磷酸醛縮酶(m.24953)；有兩個差異表達蛋白質豐度變化趨勢和其對應基因的變化趨勢相反，蛋白質豐度減少，但其對應的基因均上調，這兩個蛋白質只有玉米黃素環氧化酶(m.32969)注釋到KEGG數據庫中。

2.4 差異表達蛋白質的qRT-PCR驗證

為了驗證測序結果的可靠性，在B2和B4文庫中隨機挑選m.13192(谷胱甘肽S-轉移酶)、m.29938(L-抗壞血酸氧化酶)、m.24953(果糖二磷酸醛縮酶)、m.40032(銅氧化酶)、m.32969(玉米黃質環氧酶)、m.39316(蛋白二硫鍵異構酶A1)、m.9824(2-磷酸乙醇酸磷酸酶1)、m.16063(羧亞甲基丁烯酸酶)等8個差異蛋白質進行qRT-PCR驗證(圖3)。B2表達量歸一化為1，18 S rRNA作為內參。結果顯示：4個基因在蛋白質水平和轉錄水平均上調，4個基因在蛋白質水平上調而在轉錄水平下調，這種結果可能是由于基因轉錄、蛋白質翻譯后加工和修飾，或者mRNA和蛋白質的降解等因素造成的。

注：**表示B2和B4之間差異達0.01顯著水平；*** 表示B2和B4之間差異達0.001顯著水平。Note： ** represents significant differences between B2 and B4(P<0.01),and *** represents significant differences between B2 and B4(P<0.001).

3 討論與結論

植物在受到生物脅迫(如植原體、病毒、真菌等)和非生物脅迫(如高低溫、干旱、鹽漬等)時啟動信號轉導通路，進而產生抗性[11]。相對于同源二倍體，多倍體植物的抗逆性更強，比如冷調節的穩定性[12]和光保護[13]，多倍化有助于競爭能力的進化[14]。多倍化植物在形態和生理上有一定程度的變化，如器官增大、抗逆性增強等，另外，植物內部代謝物的產量、營養成分、內源激素以及次生代謝物質等的變化也對抗逆性有所增強。文中利用iTRAQ技術對二倍體及其同源四倍體白花泡桐的蛋白質組進行了研究，從蛋白質層面上了解二四倍體植物之間生理生化指標的差異。前人研究結果表明，泡桐同源四倍體中與脅迫響應相關的基因相對于二倍體顯著上調[15-18]。此外，泡桐同源四倍體響應干旱脅迫和鹽脅迫的microRNA對應的靶基因與二倍體親本相比上調，增加了其對環境的適應性[19-21]。

與二倍體親本相比，白花泡桐四倍體參與應對生物脅迫和非生物脅迫的蛋白質差異表達。例如，在泡桐發育和脅迫耐受性中起重要作用的果糖二磷酸醛縮酶(m.24953)和L-抗壞血酸氧化酶(m.29938)。結果表明，對同源四倍體蛋白質豐度的調節可能導致了其對環境適應性的增強。因此，與二倍體親本相比，脅迫相關蛋白質和光合作用相關蛋白質在四倍體白花泡桐中的豐度均較高，為四倍體泡桐生長抗逆性強和生長速度快的優良特性提供了解釋。

在植物中抗壞血酸氧化酶(ascorbate oxidase，AAO)屬于多銅氧化酶家族，定位于植物細胞壁[22]。AAO具有重要的意義，與植物生長發育、逆境和衰老等有關[23]。AAO在四倍體白花泡桐中表達量明顯高于二倍體，對同源四倍體蛋白質豐度的調節可能導致了其對環境適應性的增強。

鎂螯合酶主要由H、I和D三個亞基組成[24-25]，通過催化原卟啉IX和Mg2+螯合形成鎂原卟啉IX，它是葉綠素合成過程中的關鍵酶。其中，鎂螯合酶H亞基為該復合體主體，在反應中起到關鍵性作用，其它亞基,如I和D亞基可能通過H亞基參與調控[26]，其表達均能影響葉綠素合成[27]。通過這3種主要亞基的協調以及配合，并在ATP驅動下，Mg2+與原卟啉IX螯合，最后推動葉綠素合成。鎂螯合酶H亞基在四倍體泡桐中表達量明顯高于二倍體，這說明四倍體在葉綠素合成、抑制黃化等方面明顯增強。

從文中的蛋白質組學和轉錄組學數據得出了不同的豐度/表達結果,這可能是因為轉錄后調控或翻譯后修飾未將基因表達差異轉化為蛋白質豐度差異，或者是因為蛋白質組學水平低估了同源四倍體與二倍體親本之間的差異，基于iTRAQ的分析，確定了差異表達蛋白質的數量估計不同樣品的倍數變化。據報道，基于iTRAQ的方法可能存在準確性低的問題，因為它們可能會系統地低估比率，尤其是當比率變化較大時[28]。蛋白質豐度和mRNA表達水平之間一致性較缺乏,主要是由以下幾個因素造成：轉錄調控和翻譯后修飾可以使蛋白質豐度和mRNA表達水平間有差異的存在,例如，調節其靶基因表達的small RNA(包括micro RNA)在許多生物學過程中(如抗病抗旱等)發揮重要作用[29];不同試驗技術的局限性也可能導致此問題;由于基因表達有一定時空特異性，因此,不同生長階段、生長部位的組織可能會導致試驗結果不同。對整個組織的蛋白質組學進行研究可能會得出更全面的信息，而對特定細胞器的研究可能會更準確地顯示差異?？傊?，盡管相關性不是很高，但轉錄組和蛋白質組數據的各自及關聯分析對于深刻了解多倍體至關重要。

本研究利用iTRAQ及液相串聯質譜技術，對白花泡桐二倍體及其同源四倍體的蛋白質組進行定量，尋找與四倍體形成相關的蛋白質和基因。在研究中獲得了二倍體和四倍體白花泡桐蛋白質圖譜，鑒定到了與抗逆和光合作用等相關的差異表達蛋白質，預測銅氧化酶、L-抗壞血酸氧化酶、鎂螯合酶與白花泡桐多倍化相關，指出了二倍體及其同源四倍體在蛋白質水平上的差異，為培育新的泡桐品種和擴大現有種質資源提供理論依據。