髓源性生長因子對糖尿病小鼠BMSCs骨向分化的影響及機制研究

劉翠 徐曉麗 李金儒 朱彪 李歡 向光大 郭紅延

隨著人口老齡化的發展，2型糖尿病患者人數迅猛增加[1]。2型糖尿病是一種以高血糖為基礎表征的慢性代謝性疾病，高血糖抑制骨髓間充質干細胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)骨向分化。因此，糖尿病患者的種植成功率遠低于健康人群[2]。骨骼也是一種內分泌器官，骨源性生長因子參與全身代謝的調節[3]。Korf-Klingebiel等[4]利用生物信息學技術從骨髓細胞中篩選出一種新型骨髓源性分泌蛋白，并將其命名為髓源性生長因子(myeloid-derived growth factor，MYDGF)，其可通過激活PI3K/Akt信號通路抑制心肌細胞凋亡，而PI3K/Akt信號通路在糖代謝的過程中發揮重要作用。本課題組的前期研究也發現，MYDGF可通過提高胰高血糖素樣肽1的分泌改善2型糖尿病小鼠的血糖水平[5]。但是，MYDGF能否促進糖尿病小鼠BMSCs成骨分化及其機制尚不清楚。因此，本研究擬以體外培養的糖尿病小鼠BMSCs為研究對象，探討MYDGF對糖尿病小鼠BMSCs骨向分化的影響及其信號機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

4 周齡雄性SPF級C57小鼠10 只及高脂飼料(60.0%的能量由脂肪供應)(北京華阜康生物科技有限公司)。重組MYDGF、茜素紅S染色試劑盒(北京百奧萊博)；α-MEM培養基、DMEM培養基(Gibco，美國)；胎牛血清(Gemini，美國)；胰酶、β-甘油磷酸鈉、左旋維生素C、地塞米松、L-谷氨酰胺、DMSO、青霉素、鏈霉素(Sigma，美國)；Trizol(Invitrogen，美國)；CCK-8試劑盒(武漢博士德)；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(上海碧云天生物)；兔抗人磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)單克隆一抗, 磷酸化PI3K(p-PI3K)單克隆一抗、兔抗鼠蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)單克隆一抗，磷酸化Akt(p-Akt)單克隆一抗、山羊抗兔單克隆二抗(Cell Signaling Technology，美國)；CD44、CD45、CD31、CD34、CD73、CD90、CD105、CD29抗體(BD Biosciences，美國)；BCA測定試劑盒(南京建成)；PVDF膜(Millipore，美國)。

MCO-15AC型二氧化碳恒溫培養箱(Sanyo，日本)；SW-CJ-1FD型生物凈化工作臺(蘇州安泰)；穩豪倍優型血糖儀(強生公司，美國)；5702R型低速離心機、Biophotometer核酸蛋白測定儀(Eppendorf，德國)；340型酶聯儀(BDSL，英國)；CytoFLEX 型流式細胞儀(Beckman Coulter，美國)；DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型轉膜儀(北京六一儀器)；BX-53型正置熒光顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 糖尿病小鼠造模

10 只C57小鼠給予高脂飼料喂養4 周，小鼠禁食12 h后按照50 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，連續注射5 d。注射1 周后檢測血糖，以空腹血糖≥7.0 mmol/L和(或)餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L作為造模成功的標準，共成功造模7 只。

1.3 全骨髓貼壁法分離、培養BMSCs

無菌條件下分離糖尿病小鼠雙側脛骨，鈍性剝離肌肉，將脛骨浸入PBS緩沖液中，剪掉干骺端，暴露髓腔。使用1 ml注射器抽取PBS緩沖液反復沖洗髓腔，將沖出的骨髓液1 000 r/min離心后棄上清；然后，用α-MEM培養液重懸細胞沉淀，接入細胞培養瓶中培養，4 d后全換液。待細胞長滿瓶底面積的90%時，開始傳代。

1.4 BMSCs表型鑒定

0.5 g/L胰酶消化第3代BMSCs制成2×105/ml單細胞懸液備用。使用200 μl EP管，分別加入熒光標記的抗CD44、CD45、CD31、CD34、CD73、CD90、CD105、CD29抗體，4 ℃避光孵育30 min。然后，使用PBS緩沖液洗去未結合的抗體，上機檢測。

1.5 細胞增殖活性檢測

取第3代BMSCs單細胞懸液，以2.0×103/孔的密度接種于96 孔板，分別加入0(對照組；Vehicle)、25、50、100、200 ng/ml MYGDF(每組5 個復孔)。接種24 h后檢測，連續檢測6 d。檢測時每孔中加入10 μl CCK8溶液，避光孵育培養2 h，CCK-8實驗檢測波長450 nm處的吸光度值(A值)。

1.6 ALP活性定量

將BMSCs以5.0×103/孔的密度接種于96 孔板，待細胞長滿孔底面積的80%時，換為成骨誘導液培養。同時加入0(對照組；Vehicle)、25、50、100、200 ng/ml MYGDF(每組3 個復孔)，分別于成骨誘導后的第1、3、5、7天，按試劑盒說明檢測。因MYGDF可呈濃度依賴性地升高ALP活性，且100 ng/ml與200 ng/ml 濃度對升高ALP活性的作用無差異，故以下實驗采用100 ng/ml MYGDF作為干預濃度。

1.7 qPCR檢測成骨相關基因

加或不加100 ng/ml MYGDF的BMSCs成骨誘導培養3 d后提取總RNA，再將RNA反轉錄為cDNA并進行擴增，擴增條件參照既往報道[6]。檢測Runt相關轉錄因子(runt-related transcription factor 2，Runx2)、鋅指結構轉錄因子(Osterix，Osx)、ALP和骨鈣素(osteocalcin，OCN)等基因，基因引物(表 1)由上海申工生物合成。

表 1 qPCR引物序列

1.8 PI3K/Akt信號通路的檢測

取BMSCs單細胞懸液，以6.0×106/孔的密度接種于24 孔板，待細胞長滿板底面積約75%時，換為成骨誘導液培養。實驗分為3 組(每組5 個復孔)進行藥物干預：Vehicle組，MYGDF組和MYGDF+LY294002(PI3K特異性抑制劑)組。加藥順序：先加LY294002(50 μmol/L)預處理30 min，然后加入MYGDF。加藥完成后繼續成骨誘導培養72 h，提取總蛋白，每個樣本取50 μg總蛋白，電泳，轉膜，封閉，加抗體，顯影，最后使用Image J軟件分析膠片灰度；加藥后繼續成骨誘導培養21 d行茜素紅染色。

1.9 統計學分析

使用GraphPad Prism 7.0進行單因素方差統計分析，檢驗水準α=0.05。實驗步驟至少重復3 次。

2 結 果

2.1 BMSCs的形態及表面標志物

分離的BMSCs體外培養3 d后即有細胞貼壁生長，呈集落樣，形態不規則。1 周后，貼壁生長的細胞數目增多。約9 d后，細胞鋪滿瓶底面積的90%，開始傳代培養。傳代后細胞呈長條狀或者紡錘狀(圖 1)，生長迅速，4～5 d便鋪滿瓶底面積的90%。干性鑒定結果顯示(圖 2)：BMSCs不表達造血干細胞表面標志物，CD31(0.20%)，CD34(0.41%)，CD45(0.65%)；高表達間充質干細胞表面標志物，CD44(99.99%)，CD73(99.76%)，CD105(93.50%)，CD29(99.73%)和CD90(98.40%)。以上實驗結果說明成功分離培養小鼠間充質干細胞。

圖 1 BMSCs形態

圖 2 BMSCs表面標志物

2.2 BMSCs的增殖

BMSCs增殖曲線測定結果顯示：與Vehicle組相比，不同濃度的MYGDF均能顯著促進糖尿病小鼠BMSCs增殖，差異有統計學意義(P<0.05)；但是，25、50、100與200 ng/ml MYGDF促進BMSCs增殖的作用組間差異無統計學意義(表 2)。

2.3 ALP活性定量

誘導培養3 d后，BMSCs的ALP活性開始上升。在第5天時，OD值達到高峰，之后開始下降。在25～200 ng/ml的濃度范圍內，MYGDF呈濃度依賴性地升高BMSCs的ALP活性，而100 ng/ml與200 ng/ml MYGDF提高BMSCs ALP活性的作用差異無統計學意義(圖 3)。因此，本實驗采用100 ng/ml MYGDF作為干預濃度。

表 2 BMSCs增殖A值

2.4 成骨基因的表達

PCR結果表明：與Vehicle組相比較，MYDGF顯著促進成骨相關基因Runx2、Osx和ALP的轉錄表達，差異有統計學意義(P<0.05)(圖 4)。

圖 3 各組細胞ALP活性

圖 4 各組細胞成骨相關基因轉錄水平

2.5 PI3K/Akt信號通路在MYDGF促進BMSCs骨向分化中的作用

Western blot結果(圖 5)顯示，與Vehicle組相比，MYDGF顯著提高PI3K和Akt的磷酸化水平(P<0.05)，而MYDGF升高p-PI3K和p-Akt表達的作用在加入LY294002后部分消失，差異有統計學意義(P<0.05)。以上實驗結果表明，在BMSCs成骨分化的過程中，MYDGF能激活PI3K/Akt信號通路。接下來，進一步采用茜素紅染色探究PI3K/Akt信號通路在MYDGF促進BMSCs骨向分化中的作用。結果顯示(圖 5)：Vehicle組相比，與MYDGF組可產生較大的礦化結節。而PI3K抑制劑LY294002可減弱MYDGF的作用，形成的礦化結節較小。以上實驗結果表明，PI3K/Akt信號通路至少部分介導了MYDGF促進糖尿病小鼠BMSCs成骨分化的作用。

3 討 論

本實驗采用糖尿病小鼠BMSCs為研究對象，發現MYDGF既可促進糖尿病小鼠BMSCs增殖，又能促進其骨向分化，并且MYDGF促進糖尿病小鼠BMSCs成骨分化的作用與激活PI3K/Akt信號通路密切相關。

圖 5 PI3K/Akt信號通路在MYDGF促進BMSCs骨向分化中的作用

骨骼是運動器官，也是機體礦物質的儲存庫，還參與造血。近年來，越來越多的研究表明，骨骼也是一種內分泌器官，骨骼來源的細胞因子能調節并維持機體糖代謝的平衡。例如：成骨細胞和骨細胞分泌的成纖維細胞生長因子23是胰島素抵抗發生的標志物[7]；成骨細胞分泌的骨鈣素可以促進胰島β細胞增殖并促進胰島素分泌[8]，而且骨鈣素還能促進葡萄糖的利用[9]；BMSCs外泌體來源的MiR-29b-3p能改善衰老相關的胰島素抵抗[10]。MYDGF是近年來新發現的一種骨髓來源的細胞因子，由單核巨噬細胞分泌[11]。本課題組前期的實驗結果表明，MYDGF能改善2型糖尿病小鼠的血糖水平[5]。本實驗在前期工作的基礎上發現，MYDGF可對抗高糖對BMSCs成骨分化的抑制作用，促進糖尿病小鼠BMSCs成骨分化。

最近有研究表明，MYDGF發揮心肌梗死的保護作用與激活PI3K/Akt信號通路有關[4]， PI3K/Akt信號通路也是胰島素發揮作用的主要信號通路。而且，在BMSCs成骨分化的過程中，PI3K/Akt信號通路也發揮重要作用。例如，利拉魯肽可通過激活PI3K/Akt信號通路促進犬BMSCs成骨分化[6]。因此，本實驗探討PI3K/Akt信號通路在MYDGF促進糖尿病小鼠BMSCs成骨分化中的作用。結果表明，MYDGF可激活PI3K/Akt信號通路；并且在特異性地阻斷PI3K/Akt信號通路后，MYDGF促進糖尿病小鼠BMSCs成骨分化的作用部分消失。但是， 阻斷PI3K/Akt信號通路后，MYDGF的作用并未完全消失，這提示MYDGF也可能通過其它信號通路進行信號轉導。 眾所周知，Wnt/β-catenin是BMSCs成骨分化的經典信號通路，而MYDGF促進糖尿病小鼠BMSCs成骨分化的過程中是否也能激活Wnt/β-catenin信號通路值得進一步研究。

Runx2和Osx是成骨細胞特異性表達的轉錄因子[12]。本實驗qPCR結果表明，在成骨分化過程中，MYDGF促進糖尿病小鼠BMSCs細胞Runx2和Osx轉錄表達。啟動Runx2和Osx的轉錄表達后可促進下游骨蛋白的表達進而調節骨形成[13]，ALP和OCN分別是成骨早期和進入礦化期的標志物[14-15]。本實驗結果還顯示，MYDGF顯著升高ALP的轉錄水平，而升高OCN轉錄表達的作用并不明顯。這可能是由于PCR實驗進行的時間是在成骨早期，所以晚期成骨分化標志物的表達并不顯著。

本研究還存在一些局限性。例如，本研究只關注了MYDGF對糖尿病小鼠BMSCs成骨分化的影響及其信號機制，而進一步探討MYDGF對正常小鼠BMSCs成骨分化的影響將會加深對MYDGF作用的了解并擴大MYDGF的應用范疇。

綜上所述，本研究發現MYDGF能夠促進糖尿病小鼠BMSCs成骨分化，因此MYDGF干預可能是未來改善糖尿病患者種植區骨量不足的一種潛在的治療方法。