髓石的理化特性研究

郜珍燕 鄭舒寧 聶敏

生物體內的鈣磷等無機離子在生物大分子的調控作用下，形成機體礦化組織的過程稱為生物礦化，形成生物礦化的無機材料廣泛存在于自然界中[1]。生物礦化有生理性和病理性兩種。生理性礦化指機體生長發育階段，無機離子和有機質結合形成的礦化組織，如骨骼，牙體組織等。而病理性礦化指機體對生物礦化的調節作用失衡，無機離子異位礦化或形成異常礦化，如髓石，腎結石，膽結石等等。

牙體組織的生理性礦化，如牙本質的礦化，是鈣磷等無機離子與成牙本質細胞分泌的膠原蛋白、磷蛋白等有機質結合，最終形成牙本質，如前期牙本質、罩牙本質等等。因秞質表面磨損、齲壞等遭受破壞，形成的反應性牙本質和修復性牙本質也屬于生理性礦化。

牙體硬組織的病理性礦化，如牙髓鈣化，是當牙髓組織由于營養不良或組織變性時，鈣鹽可沉積，并形成大小不等的不規則鈣化團塊[2]。牙髓鈣化的分類，最早是由Moss-Salentijn[3]在1988 年提出來的，他將牙髓鈣化按發生機理分為髓石(pulp stone)、小牙(denticle)和彌散型鈣化；根據組織學結構分為管狀牙本質、規則鈣化物和不規則鈣化物。

牙髓鈣化的發生率根據檢測手段、納入標準的不同，可有很大的差異。各類文獻報道的牙髓鈣化的發生率從4%～78%[5-7]。在全口牙中，至少有50%[8]的牙齒存在牙髓鈣化的現象。很多文獻認為年齡是牙髓鈣化的主要因素，也有學者認為牙髓鈣化與年齡無關。另外齲壞、外傷、治療史，外傷史等都可使牙髓鈣化的發生率提高。

髓石是牙髓鈣化的一種，主要是由于牙髓細胞的原發性鈣化產生。膠原纖維、基質及壞死細胞代謝產物形成髓石中心，隨后板層狀或放射狀的鈣化沉積，形成髓石。上皮-間葉組織的相互作用也可引起牙髓鈣化，如殘余的Hertwig上皮根鞘可誘導鄰近的間質細胞分化為成牙本質細胞，繼而逐步形成牙髓鈣化，這種鈣化結構一般是中空的。

另外在某些因素的影響下，局部堿性磷酸酶活性升高，鈣、磷離子代謝障礙，可形成鈣鹽沉積，并與變性的組織、異物一起形成牙髓鈣化。這種稱為營養不良性鈣化，常見的因素有創傷、先天性因素、感染等。

髓石的形態有很多，或大或小，一般游離存在于髓腔內，或附著于牙本質壁上。形態較大的髓石容易獲得，所以很多文獻研究的牙髓鈣化團塊其實就是髓石。

本文應用多種物理方法研究髓石的理化性質，如髓石的元素組成及比例，晶體結構和形態等，并與健康牙本質進行比較，為了解其產生機理提供理論支持。并且，本文將髓石與腎結石等等進行對比，了解它們之間的異同，探討機體鈣化產生的原因，以找到預防牙髓鈣化的方法。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

健康牙本質來源于武漢大學口腔頜面外科正畸拔除的前磨牙，牙體組織完整，無齲壞組織；髓石來源于武漢大學牙體牙髓科根管治療過程中從髓腔中取得的髓石；腎結石是由武漢大學中南醫院泌尿外科手術中取得。

收集髓石樣本66 個，其中男性30 例，女性36 例，年齡階段為20～65 歲；牙本質樣本4 個，其中男性2 例，女性2 例，年齡階段為18～25 歲；腎結石樣本5 個， 其中男性3 例，女性2 例，年齡階段為40～70 歲。

1.2 樣本準備

樣本收集后徹底清洗干凈，去除污染物。所有樣本用pH為7.4的PBS溶液漂洗，然后用不同濃度的酒精進行脫水(75% 2 d、 90% 2 d、 100% 2 d)。

1.3 立體顯微鏡觀察

立體顯微鏡可觀察物體的立體形狀、顏色及表面微細結構,并能進行顯微解剖操作,也可以觀察生物機體的組織切片等，它可以呈現三維影像，具有操作方便、直觀等優點。觀察樣本的微細結構是在口腔醫學教育部重點實驗室(武漢大學)進行的，應用的儀器是Zeiss Stemi SV 11 Apo立體顯微鏡(蔡司公司，德國)。其放大倍數為：×1.8～×412.5，連續變倍6.25∶1。

1.4 X射線成像觀察

X射線成像可以了解生物材料、復合材料、晶體等的內部結構，研究晶體缺陷形成機制等等。X射線成像是在中國科學院高能物理研究所4W1AX射線成像實驗站進行的。其納米三維成像的能量范圍是5～12 keV，光通量>1×108@8 keV，空間分辨率50～100 nm，光斑尺寸(H×V)15 μm。納米分辨三維成像顯微鏡的CCD探測器(Photonic Scinence公司，英國)配合精密樣品轉臺拍攝樣品不同角度的放大投影像，利用CT重建算法，獲得樣品的三維密度分布。

1.5 X射線熒光分析

X射線熒光分析(XRF)是一種快速、非破壞式的用于確定材料元素組分的測量方法，它對材料的要求比較低，固體、粉末、液體等都可進行分析。這種分析方法不僅可以了解材料的元素信息，還可以了解元素的含量信息。實驗中進行的X射線熒光分析是在中國科學院高能物理研究所4W1B熒光站進行的。其能量范圍是8～15 keV，光通量>1×108@15 keV，光斑尺寸(H×V)10 μm， XRF檢測限幾十ppm。結果運用PyMca軟件和Origin軟件進行分析。

1.6 X射線衍射分析(XRD)

XRD是分析材料的衍射圖譜，獲得材料的成分、材料內部原子或分子的結構或形態等信息的研究手段。本實驗是在中國科學院高能物理研究所的4B9A衍射實驗站進行。其能量范圍是4～15 keV，能量分辨率為(ΔE/E)3×10-4，光通量>1×1010@8 keV，光斑尺寸(H×V)2×1 mm2，角分辨率 0.9 角/s。

2 結 果

2.1 立體顯微鏡影像

在圖 1A～1B中，分別是將髓石放大2.5 倍及10 倍，觀察其表面結構，可以看到髓石是“晶瑩剔透”的晶體結構，表面均勻，均質。將牙本質結構放大10 倍(圖 1C)，可以看到其表面也是均質的，并且有牙本質小管的結構(紅色方框中)。在圖 1D～1E中，將腎結石放大2.5 倍及10 倍，可以看到腎結石也是“晶瑩剔透”的晶體結構，但其表面是顆粒狀的晶體。

2.2 X射線成像結果

分別將髓石及腎結石的樣本進行了斷層掃描(圖 2A～2C)和3D 重建(圖 2B, 2D)，結果中可以看出髓石是一種均質的實體，內部結構均勻。而腎結石是很多顆粒狀晶體的聚合體，每個晶體是結構均一的實體。

2.3 X射線熒光分析結果

根據4W1B熒光站通道-能量標記周期表的結果，用PyMca軟件處理結果，獲得了熒光分析圖譜(圖 3)，用Origin軟件進行了元素定量分析，獲得了不同樣本元素含量的平均值(表 1)。

通過對比發現：在髓石中，含量較高的元素是Ca、Zn、Cu、As、P、Pb等；牙本質中含量較多的元素有Ca、P、Na、Mg、Cu、Fe、Zn等；腎結石中含量較多的元素有Ca、P、Si、Cu、Hg、Fe、Pb，Zn等。

圖 1 立體顯微鏡影像

圖 2 X射線成像

圖 3 髓石、腎結石、牙本質的光譜

為了更好地看出髓石、牙本質及腎結石中的元素含量，做出了各種樣本的元素百分比圖(表 1)。

2.4 X射線衍射分析結果(圖 4)

髓石的晶體結構主要是鈣磷酸鹽晶體。表明牙本質的晶體結構主要是鈣磷酸鹽晶體?？梢钥闯瞿I結石的晶體結構主要有幾種晶體結構的混合體。

3 討 論

牙髓和牙本質在胚胎發生和結構功能方面關系密切，稱之為牙髓-牙本質復合體[9]。成牙本質細胞分化合成牙本質的有機基質，再通過磷灰石晶體的球形礦化最終形成牙本質。隨著牙本質不斷形成，成牙本質細胞向中心移動，同牙髓腔內的含多血管的結締組織一起稱為牙髓。成牙本質細胞是牙髓中的主要細胞成分，其突起深入牙本質小管中。

表 1 髓石、腎結石、牙本質的元素含量對比

圖 4 X射線衍射分析結果

通常認為髓石的產生跟牙髓細胞(主要是成牙本質細胞)的變性鈣化有關。因此我們推斷髓石與牙本質有相似的結構。我們的研究(圖 1～2)發現，髓石是均質的實體結構，沒有牙本質中的牙本質小管結構。髓石和腎結石都可能跟營養不良性鈣化有關，我們推測髓石與腎結石也有相關性。在立體顯微鏡和X射線成像(圖 1～2)的結果看，髓石和腎結石都是均質的晶體，但腎結石是多種晶體的混合體。

從X射線熒光分析結果中，可以發現髓石和牙本質的元素組成相似(圖 3)，都含有大量的Ca、P元素，還有Cu、Zn等元素。但髓石中Cu、Zn元素的比例較高。Berès等[10]將Ca作為參考元素，對比了髓石、齲壞牙本質和健康牙本質，發現髓石和齲壞牙本質中Cu/Ca及Zn/Ca的比值大于健康牙本質。

髓石與腎結石的比較可見二者也有相似元素組成，并且在腎結石中也含有較高比例的Cu、Zn元素。

研究表明Cu和Zn元素是生物體必需的微量元素，參與多種代謝過程，Ren等[11]通過多種表征方法發現，在磷灰石晶體中Zn可以替代Ca在晶格中的位置(不超過5%的含量)，而不改變晶格的參數。并且，這種整合Zn元素的磷灰石晶體可存在于多種生理或病理性礦化過程中[12-13]。一些研究已了解到Zn和Cu在骨和牙齒中可與金屬酶結合[14-15]。Berès認為Zn和Cu元素可能跟炎癥反應中的Cu/Zn 過氧化物歧化酶(SOD)有關。

本實驗結果中發現髓石中Zn和Cu的含量增加，這提示我們髓石的形成跟牙髓細胞的炎癥反應有關。腎結石中Zn和Cu的含量增加也可能跟Cu/Zn 過氧化物歧化酶(SOD)有關。

從圖4的衍射結果看，髓石和牙本質有相似的晶體組成結構，即磷灰石晶體。髓石的晶體結構與牙本質和骨組織相似。腎結石是多種晶體結構組成的混合體，這與先前文獻報道的腎結石的結果一致。

研究牙髓鈣化有重要的臨床意義，不僅針對口腔方面，更有助于一些全身性疾病的診斷。牙髓鈣化通常無癥狀，有時會引起牙痛，會影響根管治療的成功率。趙源慶等[16]報道兩例髓石引起三叉神經樣疼痛的病例。N?sstr?m等[17]通過研究表明髓室狹窄和髓室內鈣化的患者終末期腎病的發生率增高。另外，Edds等[18]對有牙髓鈣化的患者做了問卷調查，結果顯示74%的患者有心血管疾病史，顯示心血管疾病和髓石有相關性，髓石的檢查可作為早期心血管疾病的篩查。

4 結 論

本研究獲得了髓石的表面與內部結構，元素組成及晶體結構等信息。發現髓石與牙本質、腎結石有相似的結構和元素組成，有足夠的理由推測髓石的發生跟牙本質的來源相似，同時髓石的產生也跟腎結石的發生相似，如營養不良性鈣化。