透明質酸微球的制備及細胞毒性的研究

張璇 李祥偉 宋文龍 倪世磊 邱瀅 劉慧敏 李娜

通過牙髓組織工程再生牙髓牙本質復合體恢復患牙生理功能的研究具有潛在的臨床應用前景。組織工程包括種子細胞、生長因子和支架三要素。其中，干細胞具有自我更新和多潛能分化的能力，是組織工程的重要種子細胞資源[1]。人牙髓干細胞(human dental pulp stem cell,hDPSCs)是牙髓組織工程選用的主要種子細胞?？紤]髓腔和根管的解剖特點，選擇方便操作的適宜的支架是牙髓組織工程的關鍵環節之一。微球是組織工程較常用的載體結構，更好地模擬了體內環境。目前，多種天然及合成材料已被用于牙髓組織再生的研究，如自組裝系統，水凝膠或生物陶瓷等[2]，乳化交聯法是較常用的微球制備方法。

透明質酸(hyaluronic acid，HA)是一種非硫酸化的糖胺聚糖，是細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的主要成分，由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸的重復雙糖組成，由于其獨特的理化性質，HA被作為一種保濕因子、潤滑劑和支架材料，具有緩沖壓力、填充劑和擴散屏障、清除自由基和調節免疫等多種生理功能[3-4]。細胞增殖過程中HA的產生增加，該聚合物可能在有絲分裂中發揮作用[5]。新證據表明，HA可誘導脂肪源性干細胞和人羊膜間充質干細胞的增殖[6-7]。殼聚糖/透明質酸納米?？梢园踩行У貙iR-148b轉染入大鼠骨髓間充質干細胞中[8]。HA在口腔疾病的治療中也得到了廣泛的應用[9]。研究表明透明質酸聯合明膠海綿在拔牙中的應用在減少術后出血、感染和腫脹方面有明顯的作用[10]。據此推測，HA微球有望成為種子細胞載體應用于牙髓組織工程，該研究未見報道。本研究通過乳化交聯法制備HA微球并進行表征，通過微球與牙髓干細胞共培養和細胞學檢測以評價該微球作為細胞載體的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

透明質酸鈉(上海源葉生物科技有限公司，分子量100～150 萬)；己二酸二酰肼(ADH，上海源葉生物科技有限公司)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞酰胺鹽酸鹽(EDC·HCL，上海阿拉丁生物試劑有限公司)；異丙醇、二氯甲烷、司盤80(Span-80)、石蠟(天津市華東試劑廠)；6 mg/ml I型膠原酶、8 mg/ml中性蛋白酶(Sigma Aldrish，美國)；噻唑藍(MTT,Amresco,美國)；雙抗(PAA，美國)；胰蛋白酶(Hyclone,美國)HDMEM培養液(Gibco,美國)；胎牛血清(Biological Industries,以色列)、恒溫細胞培養箱(Sanyo，日本)；場發射掃描電子顯微鏡(Jeol，日本)。

1.2 HA微球的制備

1.2.1 HA溶液的配置 將0.25 g的HA溶于49.75 ml的去離子水中，充分攪拌至完全溶解，配置0.5%的HA溶液50 ml,封口膜密封，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 HA交聯微球的制備 將20 ml的石蠟與0.25 ml的Span-80均勻混合作為油相。取5 ml的HA溶液，加入25 mg的ADH攪拌溶解混勻，加入適量稀釋好的0.1 mol/L的HCL水溶液調節pH為4～5，油相在中等強度的超聲下，將其逐滴緩慢加入HA溶液中，600 r/min磁力攪拌器下反應30 min；將30 mg的EDC·HCL溶于0.5 ml去離子水中，緩慢加入混合液中，室溫下反應24 h。反應結束后，在劇烈的攪拌條件下加入37.5 ml的異丙醇，3 000 r/min的條件下離心5 min，棄上清得到微球沉淀，再用一定量的二氯甲烷洗滌，超聲，棄上清得到微球。將得到的固體在通風櫥中靜置干燥。

1.3 HA微球SEM觀察

SEM觀察樣品制樣，將干燥的HA微球粉末均勻分散于粘有導電膠的電鏡樣品臺上，噴金3次，通過SEM觀察微球形貌。

1.4 HA微球的粒徑及粒徑分布

稱取20 mg的HA微球，將其懸浮在2 ml的磷酸鹽緩沖液中，待其在磷酸鹽緩沖液中達到平衡的狀態時，使用納米粒度儀測其粒徑分布。

1.5 hDPSCs的分離和培養

1.5.1 hDPSCs的分離與原代培養 實驗選取18～32 歲因阻生拔除的智齒，立刻轉移至超凈臺。用含10%雙抗(青霉素-鏈霉素)的HDMEM培養基反復沖洗牙齒表面，酒精棉球擦拭，去除表面可能附著的組織，將牙髓取出后置于1%雙抗的HDMEM培養基反復沖洗2～3 次，剪碎組織塊，1 500 r/min轉速離心3 min，棄上清，將6 mg/ml的Ι型膠原酶和8 mg/ml的中性蛋白酶1∶1混合后加入裝有組織塊的聚乙烯管中,37 ℃、5%CO2孵箱內消化40 min，每隔10 min彈起混勻，待混懸液呈云絮狀時，即刻加入含20%血清和1%雙抗的培養液終止消化，1 500 r/min離心3 min,將消化好的組織轉移至培養瓶，每3 天換液1 次，至顯微鏡下觀察細胞鋪滿培養瓶的底部。

1.5.2 hDPSCs形態觀察 倒置顯微鏡觀察并記錄hDPSCs 在不同時間點的生長狀況及形態。

1.6 HA微球的消毒及預處理

用75%乙醇對HA微球消毒30 min，PBS清洗3次，超凈臺內紫外照射滅菌3 h，再以含10%胎牛血清及1%雙抗的HDMEM孵育過夜。

1.7 MTT法檢測細胞毒性

HA微球消毒預處理，配置含材料的不同濃度梯度的培養基。取第3代hDPSCs,選擇合適的細胞數(1 d:4×103個/孔，3 d：1.5×103個/孔)接板于96 孔板中，待細胞貼壁后加入含有材料的培養基，實驗組和對照組分別設置6 個復孔，于37 ℃，5%CO2孵箱中分別培養1、3 d時，棄去原有培養基，PBS沖洗3 遍，每孔加入含20 μl MTT溶液的培養基200 μl ，按照說明書進行操作，測定其在490 nm處的吸光度(A)值。

2 結 果

2.1 反應體系大體觀

石蠟和司盤-80混合均勻，HA溶液緩慢逐滴加入后，整個反應體系開始變為乳濁液(圖 1)，隨著反應的進行，最終可見乳白色均一的混懸液。

2.2 SEM觀察結果

乳化交聯的方法制備HA微球，可見微球的形態規則，大小均勻一致(圖 2)。粒徑分析儀測定HA微球的平均粒徑為5～10 μm，粒徑分布見圖 3。

2.3 hDPSCs光鏡觀察

從健康人體的第三磨牙中分離出DPSCs群體，原代細胞(P0)培養15 d，細胞融合80%左右，細胞排列緊密，界限不清。待細胞鋪滿瓶底以1∶3比例進行傳代，第一代細胞(P1)基本為梭形，排列較規則?？傊?，hDPSCs顯示出良好的增殖能力，具有間充質干細胞典型的成纖維形態(圖 4)。

圖 1 反應體系大體觀

圖 2 HA微球的掃描電鏡觀察

圖 3 乳化交聯化學法制備HA微球的粒徑分布結果

圖 4 hDPSCs的形態(×40)

2.4 細胞毒性檢測結果

如圖 5，分別為不同濃度梯度的HA微球材料與hDPSCs共培養24、72 h后細胞的相對增殖率，24、72 h HA微球組的細胞增殖率均高于空白對照組，并隨著濃度的升高其值也逐漸增加，其中，24 h濃度大于0.4 mg/ml時比較差異有統計學意義(P<0.05),72 h濃度大于0.2 mg/ml時比較差異有統計學意義(P<0.05)，表明透明質酸微球材料可促進hDPSCs的增殖。根據RGR值, 參照《美國藥典》毒性分級法[11]，各實驗組的細胞毒性均為0 級，即無細胞毒性。

圖 5 HA微球細胞毒性檢測結果

3 討 論

作為牙髓細胞外基質的主要成分，HA在維持組織形態中發揮著重要作用，透明質酸具有良好的生物活性、生物相容性、生物降解性并可通過化學改性結合生長因子[12]。牙發育過程中，牙髓組織以不同的方式表達HA，HA有助于牙本質基質發育和牙髓生長，隨著年齡的增長，其表達逐漸減少[13]，可見HA在保持牙髓活力和誘導牙本質修復中起著重要作用，體內實驗研究表明 ，未經修飾的HA機械強度較低[14]，HA聯合其他材料的微球作為支架結合間充質干細胞可再生牙髓樣組織[15]。HA和己二酸二酰肼反應并制備水凝膠應用于組織再生，基于髓腔和根管的解剖特點，微球載體更為適宜作為牙髓再生的種子細胞載體，但HA微球作為牙髓再生支架的研究未見報道。目前制備透明質酸微球的方法如噴霧干燥法[16]，需要復雜的裝置，成本較高，本研究采用的方法簡單，成本低，利用機械攪拌裝置即可達到制備的要求，條件溫和且容易控制，制備過程中使用ADH和EDC作為反應的交聯劑，避免因使用戊二醛作為交聯劑帶來的毒性影響，微球最終為粉末狀外觀，較HA凝膠方便儲存，作為支架材料可采用注射的方法到達相應的部位，相比于凝膠易流動，其固位穩定性能更佳。本研究利用乳化-溶劑揮發法和化學交聯方法制備具有良好機械性能和細胞相容性的HA微球。本研究制備的HA微球，SEM觀察微球表面光滑，粒徑大小均勻一致，粒徑分布圖進一步驗證其為窄分布，解決了交聯反應不均勻的問題，能夠為組織工程提供優良的支架，但此方法制備的微球易粘連聚集的問題有待進一步的解決。HA凝膠顆粒具有大小可調，膠體穩定性好，細胞毒性低，表面積大，抗酶降解等優點，亦可作為理想的藥物載體。

近年來，HA生物材料的開發和應用在生物醫學領域中迅速發展，相關研究取得了長足的進展。HA是CD44的主要配體，在細胞外基質/液體中含量豐富，有助于組織的水動力學和穩態，且HA可通過與細胞表面受體(包括CD44、LYVE-1和RHAMM)結合，介導細胞增殖、遷移和分化[17]，本研究發現，DPSC可在HA微球表面粘附和增殖，可見HA微球具有良好的細胞相容性，關于其中的粘附機制有待進一步研究。組織化學研究表明，牙齒發育過程中透明質酸合成酶(HAS)的表達與CD44的表達相對應[18]。HA作為細胞外基質的主要成分之一，具有很好的生物相容性，生物可降解性，非免疫原性，在組織工程和再生醫學中發揮著重要的作用[19-20]。但天然HA生物機械性能較低，限制了其在組織工程方面的應用，利用乳化-交聯的方法制備HA微球，可提高材料的機械性能，本研究制備的HA微球不僅為細胞的生長提供更大的粘附面積，還為細胞遷移和組織延伸提供支撐。

本研究的關于DPSC在HA微球表面增殖結果表明，在相同的時間，DPSCs數目隨著HA微球濃度的增加而增多，說明HA微球具有良好的細胞相容性及促進DPSC細胞增殖的作用，因此，HA微球可作為DPSC載體應用于牙髓組織再生。另外，HA是牙髓組織中細胞外基質的主要成分之一，以HA微球最為載體進行牙髓再生，可解決部分降解殘余支架材料降解周期過長而占據一定的根管空間并阻礙再生牙髓組織進一步生長的問題[21]。HA微球可進一步修飾或結合生長因子應用于其他組織工程，HA微球具有很廣闊的應用前景。

組織工程已成為修復多種組織損傷或缺損的具有應用前景的治療方法[22-23]， hDPSCs具有良好的成牙分化潛能，可作為牙組織工程和再生的種子細胞，其在骨組織工程再生應用中也發揮著重要促成骨作用[24-25]。干細胞組織工程研究的重點是種子細胞的增殖、遷移和分化等。充足的種子細胞和良好生物相容性的支架材料是組織再生的關鍵要素。本研究制備的HA微球具有良好的細胞相容性，其可作為高質量的種子細胞支架促進hDPSCs的增殖和分化，該HA微球有望在包括牙髓組織再生在內的組織工程應用和研究方面發揮重要作用。