高效液相色譜法測定保健食品中褪黑素含量不確定度的評估

李珍妮 曾文祥

摘 要：本文根據GB/T 5009.170-2003《保健食品中褪黑素含量的測定》，即通過高效液相色譜法多次測量保健品中褪黑素的含量，建立數學模型。并根據實驗過程分析其中各種不確定度的來源，包括重復測定樣品產生的相對不確定度、校準曲線引起的相對不確定度、試樣質量的相對不確定度、試樣最終定容體積的相對不確定度。最后綜合各種不確定度因素，評估測定褪黑素的不確定度的水平。

關鍵詞：褪黑素;高效液相色譜法;不確定度

Abstract：This article passed GB/T 5009.170-2003 “Determination of Melatonin Content in Health Foods”， that is， multiple measurements of melatonin content in health products by high performance liquid chromatography to establish a mathematical model. According to the experimental process， the sources of various uncertainties were analyzed， including the relative uncertainty caused by repeated determination of samples， the relative uncertainty caused by calibration curve， the relative uncertainty of sample mass， and the relative uncertainty of final volume of sample. Finally， the uncertainty level of melatonin was evaluated by integrating various uncertainty factors.

Key words：Melatonin; HPLC; Uncertainty

中圖分類號：R155.5

褪黑素具有小劑量作用強、毒性低、無成癮性等優點，被廣泛接受和使用[1]。實驗室有必要開展褪黑素含量檢測以判定產品是否符合要求。對于第三方檢測實驗室，不確定度測量是質量控制的一部分，實驗室應識別測量不確定度的貢獻[2]。對檢測和校準結果測量不確定度來源的識別應從分析測量過程入手，即對測量方法、測量系統和測量程序作詳細研究[3]。

1 實驗目的

評估高效液相色譜法測定保健食品中褪黑素含量的不確定度。

2 測定方法

2.1 主要儀器和試劑

高效液相色譜儀（配紫外檢測器），電子天平，褪黑素標準物質，一級水。

2.2 方法依據

國家標準《保健食品中褪黑素含量的測定》

（GB/T 5009.170-2003）。

2.3 試樣溶液制備

精確稱量一粒片劑或膠囊于100 mL容量瓶中，以70%乙醇溶解后，超聲波提取10 min。將提取液離心至澄清，取上清液1 mL于10 mL容量瓶中，以流動相定容至刻度線，經0.45 μm濾膜過濾后上機測試。

2.4 標準溶液的制備

稱取31.8 mg褪黑素標準品（純度99.5%）于100 mL

容量瓶中，用70%乙醇溶解并定容，得到濃度為316 μg·mL-1的褪黑素標準母液。然后稀釋至7.91、15.8、31.6、63.2 μg·mL-1和158 μg·mL-1的標準系列溶液。

2.5 色譜條件

流動相：甲醇+水+三氟乙酸=45+55+0.05;流速1.0 mL·min-1;柱溫為室溫;進樣量10 μL;色譜柱Symmetry C18，150 mm×3.9 mm，5 μm;檢測波長222 nm。

3 數學模型

褪黑素含量的計算公式為：

（1）

式（1）中，X-試樣中褪黑素含量，單位為mg·kg-1;

c-由校準曲線得到的測試液中褪黑素酸含量，單位為μg·mL-1;V-樣品提取液體積，單位為mL;m-所取試樣質量，單位為g;f-樣品提取液的稀釋倍數。

4 不確定度的來源分析

高效液相色譜法測定保健食品中褪黑素含量的過程中，不確定度來源主要有：①重復測定樣品產生的相對不確定度urel（r）。②校準曲線引起的相對不確定度urel（cal）。③試樣質量的相對不確定度urel（m）。④試樣最終定容體積的相對不確定度urel（V）。

5 標準不確定度的評定

5.1 重復測定樣品產生的相對不確定度urel（r）

在重復性條件下，對褪黑素原料樣品進行7次測定，結果分別為1.015×106、0.946×106、0.976×106、

1.021×106、0.990×106、0.993×106 mg·kg-1和

0.974×106 mg·kg-1，則褪黑素含量的算術平均值x=0.99×106 mg·kg-1。

單次測量不確定度：

（2）

測量平均值的不確定度：

（3）

測量平均值相對不確定度：

（4）

5.2 校準曲線引起的不確定度urel（cal）

5.2.1 標準溶液配制引起的相對不確定度urel（c）

褪黑素標準溶液的配制可能產生不確定度，其來源包括：①標準物質純度引起的不確定度。②標準物質稱量引起的不確定度。③標準物質的溶解、定容及稀釋過程產生的不確定度。

（1）標準物質純度引起的不確定度。本實驗采用Dr.Ehrenstorfer公司的褪黑素標準物質，其證書給出的信息是純度99.5%，不確定度±0.5%，此不確定度可考慮為矩形分布，則其標準不確定度為：

（5）

相對標準不確定度

（6）

（2）標準物質稱量引起的不確定度。標準物質的稱量采用Sartorius BT224S電子天平，其檢定證書給出的示值誤差的擴展不確定度U為0.3 mg，包含因子k=2，則其標準不確定度為0.15 mg，由于實際稱量兩次（毛重-皮重），因此稱量0.031 6 g褪黑素標準物質時，其相對標準不確定度

（7）

（3）標準物質的溶解、定容及稀釋過程產生的不確定度。在標準物質溶解、定容及稀釋過程中，不確定度主要來源于所使用量具體積的不確定度，實驗進行過程中實驗環境溫度與量具計量時溫度不同產生的不確定度。

稱量好的褪黑素標準物質溶解、定容于100 mL容量瓶，得到標準母液。實驗中使用100 mL容量瓶定容，100 mL容量瓶的相對不確定度urel（V1）包含兩部分：①容量瓶體積的不確定度。根據JJG 196-2006的規定，A類100 mL容量瓶的容量允差為±0.10 mL，按三角分布換算成標準偏差為。②容

量瓶中溶液的溫度與計量時的溫度不同引起的體積不確定度。因液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，此處可只需考慮液體。假設實驗室溫度在±5 ℃變化，溫度變化按矩形分布，水的體積膨脹系數為2.1×10-4，則由溫度變化引起的不確定度=，以上二項合成，得出100 mL容量瓶的相對不確定度：

（8）

標準母液由分度吸量管轉移至10 mL容量瓶?？紤]標準系列的中間點，1 000 μL移液器轉移1 mL

標準母液的相對不確定度urel（V2）包含兩部分：①1 000 μL

移液器體積的不確定度。根據移液器（XQJS12022）的校準證書，其擴展不確定度U=0.67 μL，包含因子k=2，則其標準不確定度為0.34 μL。②移液器中溶液的溫度與校準時的溫度不同引起的體積不確定度。因液體的體積膨脹明顯大于移液器本身的體積膨脹，此處可只需考慮液體。假設實驗室溫度在±5 ℃變化，溫度變化按矩形分布，水的體積膨脹系數為2.1×10-4，則由溫度變化引起的不確定度=，以上二項合成，得出1 000 μL移液器的相對不確定度：

（9）

吸取的標準母液定容至10 mL。實驗中使用10 mL

容量瓶定容，得到測試用溶液，10 mL容量瓶的相對不確定度urel（V3）包含兩部分：①容量瓶體積的不確定度。根據JJG 196-2006的規定，A類10 mL容量瓶的容量允差為±0.02 mL，按三角分布換算成標準偏差為。②容量瓶中溶液的溫度與較正時的溫度不同引起的體積不確定度，因液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，此處可只需考慮液體。假設實驗室溫度在±5 ℃變化，溫度變化按矩形分布，水的體積膨脹系數為2.1×10-4，則由溫度變化引起的不確定度，以上二項合成，得出10 mL容量瓶的相對不確定度：

（10）

以上3項合成，得到標準物質的溶解、定容及稀釋過程產生的不確定度：

（11）

將上述三項合成，得到標準溶液配制引起的相對標準不確定度

（12）

5.2.2 校準曲線擬合引起的相對不確定度urel（f）

褪黑素標準工作曲線的繪制：采用標準母液配制標

準系列濃度為7.91、15.8、31.6、63.2μg·mL-1、158 μg·mL-1

的褪黑素工作液，5種濃度的工作液分別上機測定3次，濃度與峰面積的對應的關系見表1。

標準工作曲線為y=60 215x+20 936，相關系數R2=0.999 9，樣品測試次數p=3，總校準點N=15。

校準曲線擬合的標準不確定度為：

（13）

式（13）中：x0-測得的褪黑素含量的估計值，為31.4 mg·L-1;x-繪制校準曲線時已知濃度值的平均值，為55.3 mg·L-1，b-校準曲線的斜率;SR-峰面積的殘余標準差。

經計算：

（14）

（x0-x）2=571.2（15）

（16）

代入公式后，得到校準曲線擬合引起的樣品中褪黑素測試液含量的標準不確定度=0.54 mg·L-1。

因此，校準曲線擬合引起的相對不確定度：

urel（f）=0.54/31.4=1.72×10-2（17）

將5.2.1和5.2.2兩項合成，得到校準曲線引起的相對標準不確定度：

（18）

5.3 試樣質量的相對不確定度urel（m）

本實驗稱取樣品質量用的是賽多利斯BSA224S天平（編號1148JSS041），根據天平的檢定證書，其示值誤差的擴展不確定度U=0.3 mg，包含因子k=2，因此天平的標準不確定度為0.15 mg，由于實際稱量兩次（毛重-皮重），因此稱量0.031 0 g樣品時，其相對標準不確定度：

（19）

5.4 試樣最終定容體積的相對不確定度urel（V）

樣品是褪黑素原料，其中褪黑素的含量幾乎為100%，其溶解、稀釋定容的過程與標準品相近，其最終定容體積的相對不確定度的計算過程也與標準品一致，其結果可套用標準溶液配制的不確定度結果：

urel（V）=urel（V0）=1.42×10-3（20）

6 合成標準不確定度

綜合以上計算，保健品中的褪黑素測量不確定度來源及數值見表2。

（21）

7 擴展不確定度

取包含因子為k=2，置信水平為95%，相對擴展不確定度：

U（95）=K×urel=2×2.19×10-2=4.4×10-2（22）

8 結果報告

樣品中褪黑素的含量的擴展不確定度為（0.99×106±4.4×104）mg·kg-1（包含因子K=2，置信水平為95%），或99%±4.4%。

參考文獻：

[1]李慧艷.褪黑素用對了才助眠[J].大眾健康，2020（6）：64-65.

[2]中國合格評定國家認可委員會.CNAS-CL 01：2018 檢測和校準實驗室能力認可準則[S].2019.

[3]中國合格評定國家認可委員會.CNAS-GL 05：2011 測量不確定度要求的實施指南[S].2011.