高效液相色譜法串聯質譜法檢測南美白蝦中呋喃唑酮代謝物的不確定度評定

蒙麗瓊 李晨曦 梁任佳 李學勁 馮光毅

摘 要：目的：評定高效液相色譜法串聯質譜法檢測南美白蝦中呋喃唑酮代謝物（AOZ）殘留量的不確定度。方法：通過分析不確定來源并計算合成不確定度，最終得到南美白蝦中呋喃唑酮代謝物的擴展不確定度。結果：當南美白蝦中呋喃唑酮代謝物含量為1.93 μg·kg-1時，在95%的置信區間下，擴展不確定度為0.21 μg·kg-1（k=2）。

結論：實驗過程的不確定度主要來源于標準曲線擬合過程和標準溶液配制所產生的不確定度。

關鍵詞：高效液相色譜法串聯質譜法;南美白蝦;呋喃唑酮代謝物;不確定度

Abstract：Objective： To evaluate the uncertainty for the determination of AOZ residue in vannamei shrimp by HPLC-MS. Method： the sources of uncertainty that may be introduced were analyzed and each component of uncertainty was quantified and used to calculate combined uncertainty，and get the expanded uncertainty of AOZ residue in vannamei shrimp. Results： When the total content of? AOZ residue in vannamei shrimp was 1.93μg·kg-1， the expanded uncertainty was

0.21 μg·kg-1 （k=2） at a 95% confidence interval.? ?Conclusion： The preparation of standard solution， calibration curve fitting and measurement repeatability were the main sources of uncertainty.

Key words：HPLC-MS; Vannamei shrimp; AOZ; Uncertainty

中圖分類號：S948

硝基呋喃類抗生素是具有5-硝基呋喃基本結構的人工合成廣譜抗菌藥物，硝基呋喃類物質在動物體內迅速分解，原藥穩定性只有數小時，呋喃唑酮是硝基呋喃的一種，其在動物體內的代謝物是3-氨基-2惡唑烷基酮（AOZ）。硝基呋喃類代謝物具有細胞誘導性、動物致癌性[1-2]。歐盟1993年將呋喃唑酮禁用于食源性動物，我國也于2002年本部禁用硝基呋喃類抗生素的禁令。在農業部193號公告中，硝基呋喃類抗生素在所有食品動物和所有用途中都被禁止使用[3-4]。然而，顯著的臨床治療效果和促生長作用，以及廉價易得的特點，使其仍然存在違法使用現象[5]。因此，動物源性食品中硝基呋喃類代謝物的檢測及其不確定的評定具有非常重要的意義。本實驗根據國家標準《動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法》（GB/T 21311-2007）評定南美白蝦中呋喃唑酮代謝（AOZ）檢測的不確定度。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

乙腈（HPLC）、甲醇（HPLC）、甲酸（HPLC）、乙酸乙酯（AR）、正己烷（AR）、鹽酸（AR）。

呋喃唑酮代謝物標準物質、同位素內標氘代呋喃唑酮代謝物標準物質，來源于農業部環境保護科研監測所。

1.2 儀器和設備

安捷倫6460C列安捷倫液相色譜串聯質譜（ESI源）;分析天平：SECURA225D-1CN型，檢定允許誤差為±0.000 05 g;電子天平：JJ1000/0.01 g～1 000 g，

允差±0.05 g。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取純2.00 g按照國家標準《動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法》（GB/T 21311-2007）進行樣品處理，過濾膜后，LC-MS/MS檢測，內標法定量。

1.3.2 色譜條件

Plus C18色譜柱（4.6×100 mm，1.8 μm）;柱溫40 ℃;進樣量20 μL;流動相A為乙腈，流動相B為10 mmol·L-1乙酸銨水溶液（pH=4.0）。梯度洗脫：

0～3 min時，20%B→40%B，3～6 min時，40%B，

6.01 min時，20%B;流速0.6 mL·min-1。

1.3.3 質譜條件

離子源：ESI（+）;掃描模式：MRM;干燥氣：溫度300 ℃，壓力45 psi，流速9 L·min-1;鞘氣溫度：250 ℃;鞘氣流速：11 L·min-1，毛細管電壓：4 000 V;定量離子：AOZ為236/134.1，AOZ-D4為240/134;定性離子對：AOZ為236/104。

1.3.4 數學模型

試樣中待測組分含量為：

（1）

式（1）中，X-樣品中待測物的濃度，單位為

μg·kg-1;C-樣液中標準工作曲線所校得到的待測物濃度，單位為μg·L-1;V-樣品定容液的體積，單位為mL;m-樣品質量，單位為g。

2 結果與分析

2.1 不確定度的來源分析

試樣中呋喃唑酮代謝物殘留量的不確定度的主要來源有樣品質量稱量、體積、被測物質量濃度、測量重復性和回收率。

2.2 不確定度的評定

2.2.1 樣品稱量的不確定度u（m）

稱取2 g南美白蝦樣品，天平最大允許誤差為±0.01 g，按照矩形分布s計算，其標準不確定度u（m）和相對標準不確定度urel（m）分別為：

2.2.2 體積產生的不確定度u（V）

樣品濃縮后，用2 mL分度吸量管移取2 mL0.1%甲酸水溶解蒸殘物。2 mL分度吸量管體積允許誤差為±0.012 mL，按照均勻分布計算，其不確定度為：

溫度的變化范圍為（20±5）℃，水的膨脹系數

β膨脹水為0.001 80 ℃-1，溫度變化引起水的體積變化，按照均勻分布計算，產生的不確定度為：

則定容時引入的標準不確定度為：

（2）

2.2.3 被測物的質量濃度產生的不確定度u（C）

C的不確定度由標準系列溶液配制、儲備液的稀釋以及標準曲線溶液的配制、標準曲線擬合而得。

（1）標準儲備液配制引入的不確定度u（C-1）。呋喃唑酮代謝物（AOZ）標準值100 μg·mL-1，擴展不確定度為0.10 μg·mL-1，k=2;呋喃唑酮代謝物-D4溶液標準值50 μg·mL-1，擴展不確定度為3 μg·mL-1，k=2。使用1 mL移液器移取1 mL呋喃唑酮代謝物（AOZ）至10 mL容量瓶中，用乙腈定容配制成

10 μg·mL-1的AOZ儲備液，使用1 mL移液器移取1 mL呋喃唑酮代謝物-D4溶液標準物質至50 mL容量瓶中，用乙腈定容配制成1 μg·mL-1的AOZ-D4儲備液。

呋喃唑酮代謝物（AOZ）標準品和呋喃唑酮代謝物-D4溶液標準物質引入的相對不確定度為：

（2）標準溶液稀釋產生的不確定度u（C-2）。用

1 mL單標線吸量管移取儲備液1 mL于10 mL容量瓶（A級）中，用乙腈定容至刻度，搖勻，得到10 μg·mL-1的標準溶液（1∶10稀釋）。按照均勻分布處理，玻璃器具及溫度波動引入的不確定度見表1。

則由AOZ儲備液由100 μg·mL-1稀釋到

10 μg·mL-1過程產生的相對標準不確定度為：

同理，再逐級稀釋到100 ng·mL-1，則得到AOZ儲備液稀釋過程產生的相對標準不確定度為：

則由AOZ-D4儲備液由50 μg·mL-1稀釋到

1 μg·mL-1過程產生的相對標準不確定度為：

同理，再逐級稀釋到100 ng·mL-1，則得到AOZ-D4儲備液稀釋過程產生的相對標準不確定度為：

（3）標準曲線配制過程產生的不確定度u（C-3）。

使用20、100、200 μL移液器分別移取適量的

100 ng·mL-1 A0Z標準溶液加入空白南美白蝦基質中，按照樣品處理，最終用2 mL單標移液管加入2 mL 0.1%甲酸水定溶液，得到質量濃度分別為標準系列工作溶液。移液器的刻度誤差參考《移液器檢定規程》

（JJG 646-2006）的要求，按A類評定，如表2所示。2 mL單標移液管的不確定度見（2）urel（V）=0.006 0。

則標準系列溶液配制過程引入的相對標準不確定度為：

（4）標準工作曲線擬合產生的不確定度u（C-4）。將標準系列溶液，分別重復進樣3次，以峰面積（Ai）與內標峰面積（As）之比為縱坐標yi，標準溶液濃度（Ci）與內標濃度（Cs）之比為橫坐標xi，采用最小二乘法擬合而成的線性回歸方程為yi=axi+b，測定數據及計算結果見表3。取一陽性樣品，對各待測化合物濃度C0進行3次重復測定，其待測物濃度與內標濃度之比的平均值為0.971，則由標準曲線擬合產生的不確定度按（3）式計算：

（3）

式（3）中，SR-標準溶液待測物峰面積殘差的標準

差;a-斜率;b-截距;p-對樣品溶液C0的測定次數3;

n-標準溶液測試次數，n=5×3=15;x0-校準方程求得的陽性樣品溶液中待測物的質量濃度與內標濃度之比;x-標準溶液的質量濃度與內標濃度之比的平均值，結果見表4。

2.2.4 測量重復性產生的不確定度u（X）

在空白試樣中添加2 μg·kg-1的呋喃唑酮代謝物標準溶液，平行測定10次。重復測定的結果如表5所示，其中呋喃唑酮代謝物平均含量為1.94 μg·kg-1。

測量重復性產生的不確定度為：

2.2.5 回收率產生的不確定度u（R）

在空白試樣中添加2 μg·kg-1的呋喃唑酮代謝物標準溶液，平行測定10次。重復測定的結果回收率如表5所示。

回收率產生的不確定度為：

2.3 合成不確定度

由公式計算可得呋喃唑酮代謝物的合成不確定

度為：

2.4 擴展不確定度及結果表示

依據JJF 1135—2005，呋喃唑酮代謝物含量的擴展不確定度U（X）=urel（X）×X×2為0.21 μg·kg-1，故液相色譜串聯質譜法測定南美白蝦中的呋喃唑酮代謝物含量的結果（1.93±0.21）μg·kg-1，k=2。

3 結論

經實驗發現，標準曲線擬合過程和標準溶液配制所產生的不確定度最大，其次為回收率、測量重復性的影響。在檢測過程中，可通過嚴謹配制標準曲線，增加平行樣品測定次數，提高檢測人員的操作數練程度，可以降低不確定度，提高檢測結果的準確性。

參考文獻：

[1]岳振峰.食品中獸藥殘留檢測指南[M].北京：中國標準出版社，2010.

[2]徐偉，耿士偉，劉路，等.硝基呋喃類藥物及其代謝物檢測方法的研究進展[J].天津農業科學，2018，24（8）：16-20.

[3]農業部.動物性食品中獸藥最高殘留限量[Z].2002-12-24.

[4]中華人民共和國農業農村部，國家衛生健康委員會，國家市場監督管理總局.GB 31650-2019 食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量[S].北京：中國標準出版社，2019.

[5]中華人民共和國農業農村部.關于《2019年國家產地水產品獸藥殘留監控計劃》上半年實施情況的通報[Z].2019-09-09.