羥基喜樹堿脂質體的制備及其抗腫瘤效果的評價

陳文忠，莊翌，郝翌，陳家英，騰德義，段曉波，梅勝堯，杜穎,陳寶安

(1.南京綠葉制藥有限公司，江蘇 南京 210061；2.江蘇省藥物研究所，江蘇 南京 210009；3.東南大學附屬中大醫院 血液科，江蘇 南京 210009)

羥基喜樹堿是20世紀60年代從喜樹堿中分離得到的一種吲哚生物堿，對人類惡性腫瘤具有廣泛的抗腫瘤活性，其機制與選擇性抑制拓撲異構酶Ⅰ有關，可干擾DNA復制。由于羥基喜樹堿溶解度低、內酯環不穩定以及腫瘤中多藥耐藥相關蛋白的表達，降低了它的生物利用度，極大地限制了其在靶點的濃度和療效[1- 3]。喜樹堿羥基化衍生物屬有效的拓撲異構酶抑制劑[4]，具有更好的抗腫瘤作用、更低的毒性和更寬的抗瘤譜，其活性基團是其母體結構E環上的δ內酯環，它通過作用于拓撲異構酶Ⅰ干擾癌細胞DNA的復制，從而使癌細胞凋亡。但由于羥基喜樹堿不溶于水的性質，以及其重要活性基團δ內酯環在血循環中(血液pH約7.4)水解成羧酸型而活性降低[5- 8]，影響臨床使用的順應性及療效。為進一步開拓羥基喜樹堿的抗腫瘤作用，我們從羥基喜樹堿的遞藥系統方面著手研究，將羥基喜樹堿制成脂質體，利用小鼠肝癌H22和小鼠肉瘤S180兩種實體瘤動物模型，觀察了羥基喜樹堿脂質體的抑瘤作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

羥基喜樹堿原料藥購自美爾雅(集團)美升藥業有限公司，蛋黃卵磷脂購自南京綠葉制藥有限公司，膽固醇購自南京新百藥業有限公司；甲醇、乙腈為色譜純試劑，其他試劑為分析純；環磷酰胺批號03112721，購自江蘇省恒瑞醫藥股份有限公司。

1.2 動物

昆明種小鼠，體重18～22 g，由南京醫科大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK(蘇) 2002—0031。小鼠H22肝癌腹水型和小鼠S180肉瘤腹水型種鼠購自江蘇省腫瘤防治研究所。

1.3 羥基喜樹堿脂質體的制備

將卵黃卵磷脂、膽固醇、羥基喜樹堿溶于適量無水乙醇中，過0.22 μm濾膜除菌，濾液置茄形瓶中旋轉蒸發，減壓抽干成膜。

將枸櫞酸鈉、枸櫞酸溶于適量5%葡萄糖注射液，使最終溶液pH為5.0，過0.22 μm濾膜除菌，再將此溶液加入到上述茄形瓶中洗膜，洗膜完全后置于熱水浴中孵育20 min，再冷卻，進行高壓均質處理，并經0.22 μm濾膜過濾除菌。按每瓶含2 mg羥基喜樹堿進行分裝、凍干、壓塞、出箱、軋口，即獲得羥基喜樹堿脂質體。

1.4 羥基喜樹堿脂質體理化性質表征

1.4.1 粒徑的測定 取羥基喜樹堿脂質體適量，以注射用水稀釋，用Zetasizer 3000HS 激光粒度分析儀測定其粒徑。

1.4.2 包封率及δ內酯環占比的測定 填充Sephadex凝膠柱，并以洗脫介質平衡。取羥基喜樹堿脂質體適量，置于填充好的柱體上部，以水為洗脫介質，調整流速為1 ml·min-1，分別收集脂質體部分和游離藥部分，并分別測定其含量，計算包封率。測定脂質體中羥基喜樹堿的δ內酯環形式含量及羥基喜樹堿含量，計算δ內酯環所占比例。

1.4.3 脂質體形態觀察 取制備所得脂質體適量，稀釋至5～10 μg·ml-1后滴于銅網上，并以1.0%磷鎢酸復染，透射電鏡觀察其形態并拍照。

1.5 羥基喜樹堿脂質體對小鼠肉瘤S180 和小鼠肝癌H22實體瘤的影響

1.5.1 荷瘤小鼠模型的建立 分別取H22肝癌腹水型

和小鼠S180肉瘤腹水型種鼠，在無菌條件下抽取腹水，以無菌生理鹽水按1∶3稀釋，計數并調整濃度，每只小鼠右前肢腋下皮下接種瘤液0.2 ml。

1.5.2 動物分組與給藥 在接種后第2天將動物隨機分組并開始給藥, H22肝癌和S180肉瘤小鼠各分為8組，即空白對照組、環磷酰胺陽性藥(30 mg·kg-1)對照組、市售羥基喜樹堿注射液3個給藥濃度(14、7、3 mg·kg-1)組、羥基喜樹堿脂質體3個給藥濃度(3、2、1 mg·kg-1)組，每組10只。各給藥組每隔1天靜脈注射給藥1次，共給藥3次，空白對照組每隔1天靜脈注射生理鹽水1次，各組動物靜脈注射體積均為0.2 ml·kg-1。實驗期間每日稱量體重，本實驗重復3批。

1.5.3 血液采集與處理 在末次給藥后第5天采集各組動物血液，涂片并進行白細胞計數。

1.5.4 測定抑瘤率 在末次給藥后第5天處死動物，剝離腋下瘤塊并稱重，計算抑瘤率。

1.5.5 病理學檢測 在H22肝癌小鼠末次給藥后第5天處死動物，取出股骨, 剔除肌肉等組織，剪去股骨兩端，將骨髓滴在潔凈玻片上，用小牛血清將骨髓混勻，均勻推片，制成骨髓片，常規染色并計數。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 羥基喜樹堿脂質體粒徑

經馬爾文粒徑儀測定，所制備的羥基喜樹堿脂質體平均粒徑為357 nm。

2.2 包封率及δ內酯環形式占比

羥基喜樹堿脂質體的包封率為94.4%，滿足藥典對脂質體藥物包封率的要求；其δ內酯環形式占總含量的98%以上，表明羥基喜樹堿脂質體制劑中δ內酯環未發生降解，活性基團得到了良好的保護，有助于藥效的發揮。

2.3 羥基喜樹堿脂質體形態

透射電鏡照下羥基喜樹堿脂質體呈現規整、均一的球形結構(圖1)，且尺寸為320 nm，與粒徑測定結果一致。

圖1 透射電鏡下羥基喜樹堿的形態 ×16.2萬

2.4 羥基喜樹堿脂質體對小鼠肝癌H22和肉瘤S180實體瘤的抗腫瘤作用

不同劑量的羥基喜樹堿脂質體對H22肝癌顯示不同程度的抑制作用，3個劑量組呈明顯的劑量效應關系, 與空白對照組比較，羥基喜樹堿脂質體抑瘤率為79%～90%(P<0.001)，環磷酰胺抑瘤率平均為85.8%(P<0.001)； 3 mg·kg-1羥基喜樹堿脂質體抑瘤率平均為89.5%,3 mg·kg-1市售羥基喜樹堿抑瘤率平均為27.5%,二者抑瘤率差異有統計學意義(P<0.001)。見表1。

表1 羥基喜樹堿對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

不同劑量的羥基喜樹堿脂質體對小鼠S180肉瘤顯示不同程度的抑制作用，3個劑量組呈明顯的劑量效應關系, 與空白對照組比較，羥基喜樹堿脂質體抑瘤率為51%～68%(P<0.001)，環磷酰胺抑瘤率平均為73.6%(P<0.001)； 3 mg·kg-1羥基喜樹堿脂質體抑瘤率平均為67.2%,3 mg·kg-1市售羥基喜樹堿抑瘤率平均為20.7%,二者抑瘤率差異有統計學意義(P<0.001)。見表2。

表2 羥基喜樹堿脂質體對S180荷瘤小鼠瘤體生長的影響

2.5 羥基喜樹堿脂質體對小鼠外周血白細胞及骨髓的影響

除市售羥基喜樹堿3 mg·kg-1和羥基喜樹堿脂質體1 mg·kg-1組白細胞總數未見明顯下降，其余劑量組白細胞總數有所下降，與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；羥基喜樹堿脂質體及市售羥基喜樹堿注射液給藥組白細胞數量隨著劑量的增加而減少，均呈現劑量相關性。見表3、4。

表3 羥基喜樹堿脂質體對H22荷瘤小鼠白細胞總數的影響

表4 羥基喜樹堿脂質體對S180荷瘤小鼠白細胞總數的影響

羥基喜樹堿脂質體各劑量給藥組未見對骨髓細胞有抑制作用，與空白對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。市售羥基喜樹堿注射液14 mg·kg-1組中幼紅細胞數量與空白對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，7、3 mg·kg-1組未發生明顯變化，推測該變化可能與市售羥基喜樹堿注射液高劑量用藥相關；環磷酰胺給藥組多種骨髓細胞(晚幼紅細胞、原始粒細胞、中性中幼粒細胞、中性晚幼粒細胞、中性桿狀粒細胞)數量發生明顯變化，與空白對照組相比，差異有統計學意義(P<0.001)，表明30 mg·kg-1環磷酰胺對小鼠骨髓細胞具有損傷作用。見表5。

表5 羥基喜樹堿脂質體對骨髓細胞分類的影響

3 討 論

國內外已有采取脂質體等制劑手段改善喜樹堿類藥物穩定性的研究。2000年Tracli等[9]報道了拓撲替康脂質體的研究情況，在小鼠靜脈給藥后測定小鼠血液中閉環拓撲替康的含量，與拓撲替康水針劑進行比較。他們的研究結果表明：在拓撲替康水針給藥5 min后，血液中的拓撲替康只有50%為閉環形式；而拓撲替康脂質體給藥4 h后，血液中的拓撲替康仍有95%為閉環形式。該研究證明了將拓撲替康包裹于脂質體中能很好地達到保護δ內酯環的目的。Thomas G Burke等[10]報道喜樹堿類新衍生物Lurtotecan以脂質體為載體，在動物試驗中可以顯著增加抗腫瘤效果，認為脂質體可以穩定喜樹堿類的內酯環，比如在PBS緩沖液中3 h Lurtotecan脂質體內酯環>90%，而普通Lurtotecan僅有15%，在人體血液中3 h Lurtotecan脂質體內酯環仍有80%。

在本研究中，我們采用薄膜分散法制備了羥基喜樹堿脂質體，其粒徑為357 nm，包封率為94.4%，方法簡單易行，易于產業化生產。

我們進一步對羥基喜樹堿的體內藥效和安全性進行了評價，結果表明，羥基喜樹堿脂質體對小鼠肝癌H22和小鼠肉瘤S180腫瘤生長有較強的抑制作用，相同劑量下，羥基喜樹堿脂質體抑瘤效果為市售羥基喜樹堿注射液的3～4倍。羥基喜樹堿脂質體顯著的抑瘤效果可能與羥基喜樹堿的脂質體劑型相關，將羥基喜樹堿制備成脂質體后改善了羥基喜樹堿的水溶性，優化了體內的藥動學行為，使其在體內的半衰期延長，穩定了羥基喜樹堿在體內的內酯環結構，同時羥基喜樹堿脂質體也更容易進入腫瘤細胞，從而提高了抗腫瘤藥效。在H22肝癌小鼠和S180肉瘤小鼠的各給藥組(除小劑量組)白細胞總數有所下降，與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；而羥基喜樹堿脂質體與市售羥基喜樹堿注射液各給藥組相比，白細胞總數無明顯差異，但兩者給藥后體內白細胞總數均隨著給藥劑量的增加而減少，表明血液中白細胞總數的減少與供試品和對照品相關，呈現出劑量相關性；在H22肝癌小鼠中，各劑量給藥組均未見對骨髓細胞有抑制作用。本實驗結果顯示，羥基喜樹堿脂質體具有比羥基喜樹堿注射液更好的抑瘤效果，同時未增加羥基喜樹堿注射液毒性。

傳統的治療惡性腫瘤方式以靜脈注射化療藥物為主，但是這種方式的藥物選擇性相對較差，且毒副作用較大。因此基于藥物傳遞系統進而將藥物有效地遞送至腫瘤部位，對減輕毒副作用和增強抗腫瘤效果有很大的幫助[11]。長期以來，南京綠葉制藥有限公司在研制脂質體新劑型和符合我國國情的脂質體膜材料即高純度蛋黃卵磷脂方面積累了較為豐富的經驗。國外喜樹堿類脂質體的研究，大多采用合成磷脂(DPPC、Sphingomyelin、DLPC、DSPC)為膜材料，結合國情，我們采用了資源豐富的雞蛋黃卵磷脂替代DSPC等合成磷脂，解決了由于羥基喜樹堿為水不溶、脂難溶性藥物，難以達到較高的包封率的難題。我們研制的羥基喜樹堿脂質體包封率達到93%以上，平均粒徑在350 nm左右，藥效學研究結果達到預期研究目的，羥基喜樹堿脂質組合物及其制備方法已申請并獲得國家發明專利授權(專利號：ZL200310112772.6)。

綜上所述，羥基喜樹堿脂質體的研發成功，將使我國特有的重要廣譜抗癌藥羥基喜樹堿資源進一步得到深入的開發，為我國乃至全世界廣大腫瘤患者帶來福音，使他們獲得新生或者延長生命，改善生活質量。