山茱萸-肉蓯蓉藥對治療帕金森的網絡藥理學研究

于迎春，趙 陽，梁素萍，鄭景輝

（廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西南寧 530001）

帕金森?。≒arkinson’s disease,PD）是一種進行性、多灶性神經退行性疾病,約1% 的60歲以上人群受其影響［1］,其發病率隨年齡增長逐漸升高。目前,PD的病因未明,其具體發病機制尚不明確,主要認為與神經炎癥、氧化應激、基因突變、免疫學異常、細胞凋亡、線粒體損傷等有關［2-4］。臨床上PD最常用的治療方案是多巴胺替代療法,但只控制臨床運動癥狀,不能阻止疾病的進展,且長期的藥物治療可能導致嚴重的、不可逆的運動并發癥。其他治療方法主要包括外科治療,如毀損手術、腦深部剌激等,干細胞療法［5］,中醫針灸、運動療法、音樂療法等輔助療法治療PD,但均不可以徹底治愈。

山茱萸-肉蓯蓉藥對來源于地黃飲子,出自于《黃帝內經·素問·宣明論方》,為補腎化痰名方,具有滋陰、補陽、開竅化痰之功效,山茱萸、肉蓯蓉陰陽并補,共為君藥,兩藥相使為用,發揮功效,其中山茱萸具有補益肝腎、收澀固脫等功效,現代藥理學研究表明其具有明顯的抗氧化、抗炎殺菌、降血糖等功效。肉蓯蓉具有補腎陽、益精血、潤腸通便之功效,現代藥理學研究表明肉蓯蓉具有神經細胞保護、抗氧化、抗衰老、調節免疫等作用。目前山茱萸-肉蓯蓉藥對在臨床治療帕金森病中廣泛應用,但其治療帕金森的確切機制尚不明確,本研究采用網絡藥理學的方法,通過相關數據庫對山茱萸-肉蓯蓉藥對所包含的有效成分及作用靶點進行篩選,并將其靶點與帕金森疾病靶點進行匹配,篩選出山茱萸-肉蓯蓉治療PD相關的關鍵作用靶點,并進一步分析其治療PD的物質基礎和作用機制。

1 材料與方法

1.1 山茱萸與肉蓯蓉藥物成分信息獲取及整理 使用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP）收集中藥山茱萸、肉蓯蓉的化合物,并以口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%、類藥性（drug likeness,DL）≥0.18,因有研究發現帕金森病患者血腦屏障受損［6］,故設定血腦屏障通透性（BBB）≥-0.85,為限定條件對所收集到的化合物進行篩選,將最終篩選出的化合物建立有效化合物數據庫。

1.2 山茱萸-肉蓯蓉藥對作用靶點的預測 運用中藥分子機制生物信息學分析工具（a bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine,BATMAN-TCM）（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php/Home/Index/index）對運用TCMSP篩選出的山茱萸-肉蓯蓉藥有效化合物作用靶點進行預測。

1.3 有關帕金森病相關基因篩選 將 “Parkinson’ s disease” 作為檢索詞,通過GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）檢索帕金森病相關靶點。GeneCards數據庫通過Gifts算法,能夠準確計算靶點與疾病的相關度,并按照相關度進行評分排序。本研究選取其中最低分超過20分的前237位靶點進行研究,其中最高分146.47分,并摘錄相應的靶點的標準基因名。

1.4 山茱萸-肉蓯蓉對帕金森病作用靶點的預測及PPI網絡構建 首先將預測所得的山茱萸-肉蓯蓉藥對作用靶點與篩選出的帕金森相關發病靶點導入VENNY2.1 （http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）,得出兩者共同靶點,即可能作用于帕金森病的靶點。后將所得共同靶點與其化合物相對應,使用Cytoscape 3.6.1軟件做出化合物-靶點圖。并將山茱萸-肉蓯蓉藥對作用于帕金森病的靶點上傳至STRING 10.5數據庫中（https：//string-db.org）,選擇研究物種為“Homosapiens” （智人）,設定靶點間最低聯系分數為0.4分,隱藏無相互關聯的靶點,獲得靶點聯系網絡圖,最后將該圖導入Cytoscape 3.6.1軟件中構建PPI網絡圖。

1.5 山茱萸-肉蓯蓉對帕金森病作用靶點的GO分析和KEGG分析 將山茱萸-肉蓯蓉對帕金森病作用靶點導入DAVID Bioinformatics Resources 6.8數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）,選擇其中分子功能（molecular function）、生物過程（biologica process）和細胞成分（cellular component）3項對山茱萸-肉蓯蓉作用于帕金森病的靶點進行GO富集分析,篩選具有顯著差異的生物過程及可靠的靶點通路,并且使用GraphPad Prism 7軟件將GO富集分析滿足P＜0.05的結果做成可視化條形圖。選擇KEGG進行靶點基因通路注釋分析,將得到的結果且滿足P＜0.05作為重要通路用 Omicshare （http：//www.omicshare.com/）制作成可視化氣泡圖。

2 結果

2.1 山茱萸-肉蓯蓉活性成分的篩選通過TCMSP數據庫檢索山茱萸及肉蓯蓉的所有化合物（截止時間至2018年12月）,并按照口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%、類藥性（drug likeness,DL）≥0.18和血腦屏障通透性（BBB）≥-0.85作為篩選條件,篩選獲得山茱萸的潛在活性成分16種,肉蓯蓉潛在活性成分6種,見表1。

2.2 山茱萸-肉蓯蓉化合物作用靶點的預測 將山茱萸-肉蓯蓉化合物的Pubchem Cid代碼上傳至BATMAN-TCM數據庫平臺,并設置相似性模型閥值為“Score cutoff=20”,得到各化合物所對應的潛在靶點,并按照返回靶點的得分順序排列,選各化合物取前20個靶點,不足20全部納入,并去除重復靶點后,最終得到山茱萸化合物作用靶點164個,肉蓯蓉化合物作用靶點94個。

2.3 帕金森病發病靶點篩選 通過GeneCards數據庫共檢索“Parkinson’s disease”,共獲得5 597個可能引起帕金森病相關的靶點,其中Synuclein Alpha類靶點相關度最高（146.47分）,本研究選取其中相關度得分≥20分的靶點,共篩選獲得237個相關靶點。

2.4 山茱萸-肉蓯蓉作用于帕金森病靶點預測 將將預測的山茱萸-肉蓯蓉化合物靶點及篩選得出帕金森病相關基因靶點,全部以基因名格式導入VENNY2.1軟件中,取兩者的交集,得出19個化合物與疾病共同靶點,19個具體靶點信息見表2,得出的韋恩圖如圖1所示。

2.5 化合物-靶點網絡圖的構建 將山茱萸、肉蓯蓉藥對與其21種活性成分和19個關鍵靶點基因,導入Cytoscape

表1 山茱萸-肉蓯蓉藥對化合物

表2 山茱萸-肉蓯蓉治療帕金森病的關鍵靶點

3.5.1 軟件構建山茱萸-肉蓯蓉治療帕金森病藥物-化合物-靶點相互作用的可視化網絡圖,結果見圖2。

結果顯示,有效化合物中diop （鄰苯二甲酸二異辛酯）、marckine （丁哌卡因）、quercetin （槲皮素）、yangambin （鵝掌楸樹脂醇b二甲醚）、ethyloleate （NF）（油酸乙酯）、cornudentanone （角豆酮）、3,4-dehydrolycopen-16-al上述7種成分能與2個及以上的疾病靶點基因聯系,可能是山茱萸-肉蓯蓉治療帕金森病的重要成分,可知山茱萸-肉蓯蓉治療帕金森病是多成分、多靶點共同作用。

2.6 關鍵靶點的PPI網絡構建及分析 將山茱萸-肉蓯蓉治療帕金森病的19個靶點基因導入String數據庫獲取蛋白質相互作用關系,由String數據庫得到靶點相互作用網絡圖,結果如圖3所示,其中“邊” 代表作用靶點之間的關聯,節點代表作用靶點。圖中共19個節點,70條邊,平均節點度為7.73,平均局部聚類系數0.661。靶標均以圓形節點表示,靶標之間連線越粗說明在治療帕金森病靶標網絡中的該靶點越重要。

圖1 韋恩圖

圖2 藥物-化合物-靶點互作網絡圖

圖3 山茱萸-肉蓯蓉靶點的蛋白互作網絡圖

2.7 山茱萸-肉蓯蓉對帕金森病作用 靶點的GO富集分析和KEGG通路富集分對山茱萸-肉蓯蓉作用于帕金森的19個相關靶點通過David數據庫進行分析,主要包括3方面,即生物過程、分子功能、細胞成分,取P（P＜0.05）值排列前15的條目所對應靶點具有的功能信息,使用GraphPad Prism 7軟件將篩選的條目制作成可視化條形圖,見圖4。再對上述19個靶點進行KEGG通路富集分析,得到P＜0.05的通路有9條,通過Omicshare軟件進行可視化分析,結果見圖5。

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG通路富集分析高級氣泡圖

4 討論

研究發現山茱萸中主要含有環烯醚萜苷類、鞣質、黃酮、有機酸、多糖類等多種成分［7］。徐一達［8］最新研究發現山茱萸中的馬錢苷不僅抑制PD小鼠紋狀體內多巴胺和TH表達,也抑制小鼠黑質內小膠質細胞和星形膠質細胞的活性,使caspase-3、TNF-α 及其上游調控因子NF-κB、p38和c-Abl的表達下降,主要機制可能是馬錢苷抑制膠質細胞的聚集及激活、抑制炎癥因子的表達、通過c-Abl-p38-NF-κB通路來抑制細胞死亡,同時可以影響細胞的自噬來增強神經細胞的生存能力,進而起到治療PD的作用。肉蓯蓉含有苯乙醇苷類、環烯醚萜苷、木質素類等多種成分,其有效成分可以產生抑制神經細胞凋亡、增強免疫、抗氧化、抗衰老等作用［9］。王虎等［10］研究肉蓯蓉提取物對帕金森病細胞損傷模型有保護作用,其作用機制為肉蓯蓉提取物通過降低GADD153 （生長抑制DNA損傷基因153）蛋白的表達來實現。也有研究發現肉蓯蓉提取物能抑制PD小鼠黑質中多巴胺能神經元的減少,并且減少細胞凋亡、降低Bax/Bcl-2 mRNA及蛋白的比例［11］,也可通過抑制PD大鼠紋狀體及海馬的細胞外液中單胺類神經遞質含有量減少,發揮治療PD作用［12］。其中β-sitosterol為2種中藥的共同有效成分,研究表明其可以影響凋亡、炎癥、血管生成等多種信號通路,有著治療PD的潛在作用［13］。

本研究使用網絡藥理學研究方法,篩選山茱萸-肉蓯蓉有效化合物22種,并預測出這些化合物可能作用于帕金森病的19個靶點,包括多巴胺受體 （DRD2、DRD3、DRD4）、多巴胺轉運體（SLC18A2、SLC6A3）,乙酰膽堿酯酶（ACHE）、血管緊張素轉化酶 （ACE）、蛋白激酶（AKT1）、大麻素受體 1 （CNR1）、乙醇脫氫酶 1C（ADH1C）、5-羥色胺受體（HTR1A、HTR2A）、丁酰膽堿酯酶（BCHE）、超敏反應蛋白（CRP）等,各靶點間有很強的相互作用,主要涉及多巴胺能神經元功能、乙酰膽堿系統、炎癥反應、神經毒性等生理病理改變。

帕金森病主要病理改變為黑質多巴胺能神經元變性死亡,而多巴胺作為腦內重要的神經遞質,主要通過不同亞型的多巴胺受體調控人體運動功能、認知活動等生理或病理過程,其中DRD2表達神經元通路,起到調節運動的作用［14］；DR的含有量與樹突棘密度相關,DA受體的激活可以調節軸突結構,維持大腦正常功能,DR通過調節神經遞質釋放、調節釋放頻率等調節神經元的興奮性［15］；多巴胺轉運體在多巴胺（DA）轉運過程中發揮了關鍵作用,當這些信號通路的功能紊亂時可引起帕金森病,因此多巴胺受體、多巴胺轉運體靶點為治療帕金森病的主要靶點。SLC6A3基因編碼的多巴胺轉運體（dopamine transporter,DAT）在多巴胺（DA）轉運過程中發揮了關鍵作用。ACE主要與血壓調節有關,但有研究表明ACE抑制劑可增加紋狀體多巴胺水平和減少神經元壞死,對PD模型有保護作用,也是潛在的抑郁治療靶點［16］。最新研究表明血清BChE活性可作為PD生物標志物,與帕金森病也有密切關系［17］。CRP主要與炎癥相關,而炎癥反應與帕金森病的發病和發展具有密切相關性［18］。HTR1A在抑郁癥及部分精神系統疾病的發病機制中起著重要的作用,可能是導致帕金森后期合并抑郁癥的重要原因［19］。由此可以看出上述靶標主要與神經元功能、多巴胺受體及轉運體、炎癥等諸多因素相關,既說明帕金森病的致病因素復雜,又說明山茱萸-肉蓯蓉藥對通過調節巴胺能神經元功能和乙酰膽堿系統的功能、抑制炎癥、減輕神經毒性等方面治療帕金森病。

為了詳細的探究山茱萸-肉蓯蓉有效化合物成分治療PD的生物學過程、分子功能、細胞成分和信號通路,將山茱萸-肉蓯蓉與PD相關的19個基因進行GO分析和KEGG分析。

通過GO富集分析發現山茱萸-肉蓯蓉藥對治療帕金森病主要生物過程（BP）與多巴胺分泌的調節、多巴胺代謝過程的調節、化學性突觸傳遞、突觸傳遞負調控、5-羥色胺受體信號通路、G蛋白偶聯受體信號通路、細胞鈣離子穩態、行為控制等主要生物過程相關。其中在多巴胺分泌的調節與多巴胺代謝過程的調節與治療帕金森的相關機制密切相關,因帕金森病主要是多種原因導致多巴胺能神經元損傷、凋亡,最終紋狀體內多巴胺濃度下降,導致大腦反饋調節失衡而發病。因此作用于多巴胺能系統的藥物,可通過激動多巴胺受體、多巴胺轉運體等可有效控制帕金森?。?0］。在G蛋白偶聯受體信號通路中,有研究發現在PD小鼠模型中,雷諾昔芬與G蛋白偶聯雌激素受體30結合發揮抑炎作用,可抑制炎癥通路,降低相關炎癥因子水平,從而抑制PD的慢性炎癥進展。表明G蛋白偶聯雌激素受體（GPR30）參與雌激素在PD炎癥中具有抗炎、神經保護等作用［21］。在5-羥色胺受體信號通路中,范玲玲等［22］研究發現5-HT7受體激動劑可能以多種方式調控著內側前額葉皮層（mPFC）錐體神經元的電活動,且黑質紋狀體通路的退化易導致mPFC錐體和中間神經元上5-HT7受體出現功能紊亂。這為5-HT7受體參與PD病人并發的抑郁、焦慮等癥狀提供了功能學和細胞學的解釋,也為PD治療開辟了新的研究方向。分析GO富集結果發現山茱萸-肉蓯蓉的生物過程中主要與 DRD2、DRD3、DRD4、SLC18A2、SLC6A3、HTR1A、HTR2A基因相關,說明山茱萸-肉蓯蓉可能通過對多巴胺受體、5-羥色胺受體這兩個靶點來治療PD。相關研究表明,HTR2A受體的拮抗劑在帕金森病模型上能夠減輕左旋多巴所致藥物不良反應［23］；部分DRD2激動劑不僅能改善PD的運動癥狀,且引起運動障礙和精神性疾病的副作用的概率較低［24］,說明中藥在防治PD中有很好應用前景。

GO富集分析中分子功能涉及多巴胺的結合、多巴胺神經遞質受體活性,通過Gi/Go耦合、多巴胺神經遞質受體活性、酶的結合、乙酰膽堿酯酶活性、膽堿酯酶活性、膽堿結合等。GO富集分析中細胞成分主要涉及軸突、樹突、（神經元的）突觸、突觸后膜、質膜、薄膜、膜筏等,主要涉及神經信號傳遞、神經元的組成及功能等。

通過基因KEGG通路富集分析得出山茱萸-肉蓯蓉防治PD主要調控多巴胺能神經突觸、神經活性配體-受體相互作用、cAMP信號通路、縫隙連接、5-羥色胺能突觸、信號通路、帕金森疾病等9條相關信號通路發揮作用,表明山茱萸-肉蓯蓉化合物的作用靶點有多條通路,可通過各通路協調作用治療帕金森病。在多巴胺能神經突觸、神經活性配體-受體相互作用、信號通路這3條神經遞質相關通路中,可能通過作用于多巴胺受體［25］、多巴胺轉運體、大麻素受體1、5-羥色胺受體來治療PD,也可能通過增加多巴胺神經元的數量,減輕黑質多-紋狀體巴胺能通路的變性,維持多巴胺水平的穩定。

在cAMP信號通路中,環核苷酸（cAMP）作為中樞神經系統細胞的第2信使,對神經系統活動起調節作用,包括神經元的存活、樹突和軸突的生長、神經元的發育和認知。Wu等［26］利用PD模型小鼠進行細胞試驗發現,下調miR-200a可導致AKT、cAMP、PKA表達降低,而DRD2、CREB表達升高,說明下調miR-200a通過阻斷cAMP/PKA信號通路,可增加DRD2表達,抑制紋狀體細胞凋亡進而有效控制PD。韓雪峰等［27］研究發現上調cAMP信號通路可使列當中Crenatoside （黃藥苷）對D-半乳糖誘導的PC12神經細胞損傷有明顯的保護作用。山茱萸-肉蓯蓉的有效化合物可通過調節神經元的發育、神經元的存活、樹突和軸突的生長、保護受損神經等生理過程發揮治療PD的功能。

在縫隙連接信號通路中,縫隙連接通道可通過對抗細胞間電阻,實現細胞間的興奮傳遞?？p隙連接蛋白43（Cx43）是中樞神經系統（CNS）中含有量較多的連接蛋白,并以縫隙連接 （gap junction,GJ）和半通道（hemichannel,HC）的形式存在,并介導細胞內外的信息交流與細胞間的信息交流。大量研究表明Cx43GJ和HC的改變推進了神經退變疾病進程［28-29］；PD患者可因黑質膠質細胞激活,導致大量的促炎因子表達（如IL-1β、TNFα、INF-γ）,炎癥因子最終導致星形膠質細胞Cx43GJ的改變加快PD患者病程進展［30］。研究發現［31］在PD動物模型中,總Cx43 mRNA水平與星形膠質細胞Cx43的免疫活性增加明顯,表明Cx43HC活性增加與PD的發病相關。山茱萸-肉蓯蓉藥對的有效成分對PD的治療可通過抑制促炎因子的表達,減少星形膠質細胞Cx43的改變而發揮作用。

綜上,本研究使用網絡藥理學方法對山茱萸-肉蓯蓉藥對治療PD的主要化合物、靶點、通路等進行詳細分析,初步驗證了山茱萸-肉蓯蓉藥對治療PD的主要機制,為下一步進行深入研究其作用機制提供理論基礎。本研究結論僅依靠網絡藥理學方法對相關數據庫進行挖掘得出,雖然通過相關文獻驗證了結論的可靠性,但下一步仍需通過動物實驗驗證其主要作用機理,以期為臨床治療PD提供思路。