四川省生豬屠宰企業非洲豬瘟檢測實驗室建設及生物安全技術要求

1 檢測實驗室建設要求

1.1 實驗室布局 遠離生產區，處于相對封閉區域。實驗室面積需滿足工作需要，原則上不低于30 m2，至少包括獨立的前處理室和檢測室。前處理室面積原則上不低于20 m2，檢測室面積原則上不低于10 m2。前處理室應分為樣品處理區、配液區等，嚴格分區操作。

1.2 主要儀器設備及耗材配置

1.2.1 前處理室主要儀器設備 配置離心機、高壓滅菌鍋、渦旋振蕩器、水浴鍋（金屬?。?、移動紫外燈、移液器及其配套吸頭（樣品處理區和配液區各一套移液器，不能混用），配備冷藏冷凍冰箱（存放檢測試劑、檢測樣品、滅菌后廢棄物）、儲物柜（存放EP管、PCR管、槍頭等耗材）、垃圾桶2個（1個配黑色垃圾袋，用于盛放普通垃圾；1個配黃色廢棄物專用垃圾袋，用于盛放廢棄物）。

1.2.2 檢測室儀器設備 熒光定量PCR 儀或其他檢測設備。

1.2.3 實驗耗材 采血器（或注射器）、真空采血管（EDTA 抗凝劑）、1.5 mL EP 管及其管架、PCR八聯管（與熒光PCR 儀配套）及其管架、剪刀、鑷子、搪瓷托盤、酒精燈等。

1.2.4 其他器材 實驗臺、操作椅、試劑架、器皿櫥等。

1.2.5 個人防護用品 實驗服、一次性乳膠手套、一次性口罩、一次性鞋套。

1.3 實驗室檢測人員 屠宰企業應配備專職檢測技術人員，并接受實驗室分子生物學檢測技術及生物安全相關知識培訓，熟悉非洲豬瘟檢測要求。

2 檢測實驗室操作規范

2.1 樣品采集 生豬屠宰企業應安排專人負責樣品采集，并填好采樣記錄表。樣品為生豬抗凝血（5 mL，0.5%EDTA 抗凝，不能使用肝素鈉作為抗凝劑）或全血樣品。

2.2 樣品保存 樣品采集后，按要求進行混血，混血待檢樣品需在60 ℃下進行30 min 的滅活處理，在12 h 內檢測的待檢樣品應在冰箱冷藏（4 ℃）保存，超過12 h 不能檢測的樣品和留樣需冷凍保存。留樣應至少保存3個月，以備復查。

樣品需轉運的，應按農業農村部《高致病性動物病原微生物菌（毒）或者樣本運輸包裝規范》要求進行包裝，并由專人將樣品送至實驗室，禁止使用公共交通工具運送。

2.3 樣品檢測

2.3.1 嚴格按照試劑說明書的操作步驟進行檢測。

2.3.2 采集的血液樣品，可按照生豬批次（車次）或一定的生豬數量進行混樣，具體混樣數量根據所使用的檢測試劑盒的技術指標科學確定。

2.3.3 待檢血樣必須充分混勻，使用經農業農村部批準或中國動物疫病預防控制中心對比符合要求的檢測試劑盒進行檢測。

2.3.4 熟悉操作，縮短檢測過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞。

2.3.5 所有試劑開蓋前都應先瞬時離心，避免液體飛濺；若液體不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并清潔桌面。

2.3.6 樣品處理、配液、擴增嚴格分區操作，儀器、耗材等嚴禁交叉混用。

2.3.7 加樣時嚴禁反復吹吸。

2.3.8 熒光探針應避光保存，反應液現配現用，加入核酸后應盡快上機。

2.3.9 不要在熒光定量PCR 管蓋的采光部位做任何標記。

2.4 原始記錄 檢測完成后應填寫并保存相關檢測原始記錄，檢測原始記錄、PCR圖至少保存2年。

2.5 檢測報告 根據《關于全面開展生豬屠宰環節非洲豬瘟檢測工作有關具體要求的通知》（川動監〔2019〕5號）要求，屠宰企業檢測結果應規范出具《檢測報告》，載明對應的檢疫合格證明編號、檢測方法、檢測日期、檢測結果。檢測報告必須經由報告編制人、駐場官方獸醫和批準人（場點負責人）簽字確認，加蓋屠宰企業公章方為有效。檢測報告一式兩份，一份交駐場官方獸醫存檔，一份為屠宰企業自行留存，保存期至少2年。

2.6 結果處理

2.6.1 檢測結果為陰性，則同批生豬產品可以上市銷售。

2.6.2 檢測結果為陽性，應立即停止生產，將檢測結果報告駐場官方獸醫，并及時將陽性樣品送所在縣級動物疫病預防控制中心，待復核后再做處理。復核為陽性的按照《非洲豬瘟疫情應急實施方案（2020年版）》的規定進行應急處置。

3 檢測實驗室生物安全要求

3.1 采樣生物安全

3.1.1 正確穿戴好口罩、手套、鞋套、實驗服等個人防護用品。

3.1.2 盡可能使用物理設備保定動物，既保證人的安全，又保證樣品質量。

3.1.3 一頭豬一個注射器或一個真空采血管，避免樣品交叉污染。

3.1.4 采樣結束，采樣人員脫去個人防護用品，并對采樣環境進行清潔消毒。

3.2 檢測過程中的生物安全

3.2.1 檢查樣品外包裝有無損壞，并對外包裝進行消毒。

3.2.2 注射器使用完后必須放置于專用廢棄盒中待高壓滅菌處理，高壓滅菌前不得拆卸針頭和注射器。

3.2.3 盡量使用帶濾芯的移液器吸頭，不用移液器混勻液體。

3.2.4 對于管壁上沾有懸液的離心管，應短暫離心后再打開管蓋。

3.2.5 核酸提取完成后應先更換手套再進行配液。

3.2.6 配液區和核酸提取區嚴格分開，儀器、耗材等嚴禁交叉混用。

3.3 檢測后實驗室的消毒

3.3.1 實驗室臺面、桌椅、櫥柜、門把手、水龍頭等物品的表面可用有效氯濃度為0.1%～0.5%的消毒劑噴灑，作用30 min后用清水擦拭。

3.3.2 實驗室地面可用有效氯濃度為0.1%～0.5%的消毒劑噴霧或拖地，各實驗室拖把應專用，不得混用。

3.3.3 廢液缸、剪刀、鑷子等可回收物，用消毒液浸泡30 min后用清水清洗，可高溫滅菌的用牛皮紙等包好后高壓（121 ℃，20 min）滅菌備用。

3.3.4 實驗服等可重復利用的棉織制品，可經121 ℃、20 min高壓滅菌、清洗后使用；也可用氯化物、酚化物等消毒劑浸泡30 min，清水清洗后晾干備用。

3.3.5 離心機、PCR 儀等儀器設備的金屬部件使用75%乙醇擦拭消毒，非金屬部件使用含2.3%有效氯的次氯酸鹽消毒30 min，然后清水洗凈或擦拭。

3.4 廢棄物處理

3.4.1 以下廢棄物需進行高壓滅菌處理：超過留存期的所有樣品；使用后的槍頭、EP 管、采血管等；一次性個人防護用品，如口罩、手套、鞋套等；注射器針頭等銳器使用后應直接棄置于耐高壓、防穿透的容器內。將上述廢棄物放入醫療廢物袋，并在廢物袋的中心位置放置高壓指示帶或化學指示卡，袋口應稍微扎緊（不能太緊），袋口和外表面噴灑消毒劑，121 ℃高壓滅菌處理20 min，然后將滅菌后的廢棄物存放在指定冰柜中，定期交由有資質的無害化處理企業進行無害化處理。

3.4.2 使用后的PCR 反應管（內含反應產物）直接棄置于醫療廢物袋中，禁止開蓋（以免造成氣溶膠污染），交由有資質的無害化處理企業進行無害化處理。