微泡破壞及間充質干細胞治療大鼠心肌損傷模型的有效性研究*

徐艷娟 張英強 王 婧 陳芡茹 王紅霞 顧明霞*

阿霉素是一種蒽環類的抗腫瘤藥物，其可抑制腫瘤細胞核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)合成，應用于多種惡性腫瘤的治療[1]。隨著阿霉素劑量增加，其不良反應也相應增加，可導致心肌毒性[2]。因此，尋找有效的心肌毒性防治措施具有重要意義。干細胞移植治療可促進受損心肌局部結構與功能的恢復，改善心功能。超聲微泡介導可以顯著促進骨髓間充質干細胞(bone marrow-mesenchymal stem cells，BMMSC)歸巢，改善心功能[3]。近年來，對于超聲微泡介導干細胞移植治療阿霉素心肌病的研究較少，為此，本研究通過對大鼠進行體內和體外實驗，觀察超聲微泡介導干細胞移植治療阿霉素心肌病的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取體重為120～150 g的36只雄性SD大鼠(南京醫科大學動物實驗中心)，建立阿霉素心肌病模型，采用隨機數表法將其分為磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)組、單純MSC組和超聲微泡+MSC組，每組12只。

1.2 儀器與試劑

(1)儀器設備。JH-930型超聲儀(江蘇佳華電子設備有限公司)；Sorvall Legend Micro 17型離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

(2)藥物與試劑。阿霉素(深圳萬樂藥業有限公司，國藥準字H10930106)；10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液(美國Sigma公司)；胰酶(美國Sigma公司)；PBS(美國Hyclone公司)；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)(美國Sigma公司)；碳菁熒光染料(carbocyanine fluorescent dye，CM-Dil)(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 體外實驗

1.3.1 大鼠BM-MSC的分離、培養和鑒定

將3組SD實驗大鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下取下肢長骨，用含10%胎牛血清的高糖培養基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)培養液沖洗骨髓腔獲取骨髓細胞，離心后取沉淀，用Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液分離，收集中間的細胞層，洗滌后用含10%胎牛血清的DMEM培養液混勻后接種于培養瓶中。原代細胞生長至90%融合時，用0.125%胰酶消化后按1∶3的比例傳代。

1.3.2 超聲微泡對大鼠MSC的干預與檢測

(1)超聲微泡對大鼠MSC的干預。將MSC以100μl/孔，約5×104個細胞加入培養板。培養24 h后進行干預實驗。超聲參數選擇頻率1 MHz，輸出功率1.0 W/cm2，持續輻照90 s，微泡濃度為90 μmmol/L，在超聲微泡組+MSC組中加入5 μl微泡約106個。培養板固定在保持37 ℃雙蒸水水槽表面，超聲探頭垂直置于培養板上方約8 cm處進行1.0 W/cm2、2.0 W/cm2、3.0 W/cm2的超聲強度干預，為避免超聲波對鄰近孔細胞的影響，隔孔接種細胞，每組8個復孔。

一杭不肯死心。抽屜里為什么會有鋼筆和墨水，而且墨水是新買的。如果他記下過什么，他會放在哪里？一杭又到床上翻找了一陣，枕頭里，席子下，都找過了，沒有找到想要的東西。

(2)干預后MSC結構、細胞生長與凋亡檢測。采用1.0 W/cm2、2.0 W/cm2和3.0 W/cm2強度的超聲干預，采用四甲基偶氮唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法檢測MSC活性，觀察超聲微泡干預對MSC活性的影響，觀察存活和凋亡情況，獲得不影響MSC活性的最佳參數。具體操作嚴格參照試劑盒說明書。

1.4 體內實驗

1.4.1 大鼠阿霉素心肌病模型的建立

對3組SD大鼠腹腔注射阿霉素，每次2.5 mg/kg，每周一次，用藥10周，動態檢查大鼠體表心電圖及血清肌鈣蛋白、肌酸激酶等證實成功阿霉素建立心肌病模型。

1.4.2 熒光標記MSC

采用含超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)和熒光標記方法對MSC進行SPIO標記。MSC移植前采用磁探針標記培養的MSC。

(1)SPIO標記。將SPIO轉染劑結合物納米粒子的膠體溶液加入細胞培養液中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養12 h，棄去培養液，用PBS(pH=7.14，0.01 mol/L)沖洗4次，洗掉游離的四氧化三鐵(Fe3O4)納米粒子。MSC移植前使用胰酶消化收集標記后的MSC，使MSC再次懸浮成單個細胞，調節細胞濃度至1×108/L備用。

(2)熒光標記。用二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)將CM-Dil配成2 mg/ml的母液，用PBS將其稀釋為1μg/ml。將培養至第三代的生長良好的骨髓MSC消化后用培養液稀釋成濃度為1×109/L，1 ml培養液中加入5μl的CM-Dil(1μg/ml)染液，吹勻，置于37 ℃孵育5 min，4 ℃孵育15 min，以1 500 r/min離心5 min，去上清，PBS洗滌兩次。通過熒光顯微鏡觀察標記效率。

(1)MSC移植。建模10周后進行干細胞移植(經尾靜脈注入法)，同時采用超聲儀輻照大鼠心前區，參數采用體外實驗探索的最佳照射強度及照射時間。

(2)MSC移植后情況分析。①MSC移植后的24 h行心臟超聲測量左室舒張末期容積與收縮末期容積、室壁厚度，計算左室的射血分數和室壁增厚率，評判心功能；②Tunnel染色測凋亡，MSC移植24～48 h后處死動物，取出心臟制成切片，于熒光顯微鏡下觀察Tunnel染色陽性細胞數；③處死動物取適量心肌組織置于滅酶的離心管后放入-80 ℃冰箱中保存，采用蛋白質印跡(Western blot)法檢測bcl-2、bax蛋白表達。

1.5 統計學方法

采用SPSS22.0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均值±標準差()表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，對于重復觀察測量資料，采用方差分析來進行組間比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同超聲強度對MSC活性的影響

1.0 W/cm2輻射90 s/d、120 s/d輻射后即刻、輻射后24 h及48 h的MSC吸光度水平比較，差異有統計學意義(F=9.314，P＜0.05)，且均顯著高于2.0 W/cm2和3.0 W/cm2超聲強度。2.0 W/cm2和3.0 W/cm2輻射90 s/d、120 s/d輻射后即刻、輻射后24 h及48 h的MSC吸光度水平比較，差異有統計學意義(F=8.584，F=9.026；P＜0.05)?？瞻讓φ蛰椛?0 s/d、120 s/d輻射后即刻、輻射后24 h及48 h的MSC吸光度水平比較，差異無統計學意義(F=1.616，P＞0.05)，見表1。

表1 不同超聲強度及輻射時間對MSC活性吸光度影響的比較()

表1 不同超聲強度及輻射時間對MSC活性吸光度影響的比較()

2.2 三組大鼠心肌歸巢情況比較

超聲微泡+MSC組小鼠移植部位毛細血管數、熒光標記細胞數最高，三組大鼠移植部位毛細血管數、熒光標記細胞數比較差異均有統計學意義(F=25.043，F=36.697；P＜0.05)，見表2。

表2 三組大鼠移植部位心肌組織學檢查結果比較()

表2 三組大鼠移植部位心肌組織學檢查結果比較()

2.3 三組大鼠心功能情況比較

三組大鼠的心功能左室舒張末期容積、左室收縮末期容積、室壁厚度和射血分數比較，差異均有統計學意義(F=9.075，F=27.529，F=3.594，F=62.175；P＜0.05)，見表3。

左室舒張末期容積、左室收縮末期容積以PBS組最高；室壁厚度、射血分數以超聲微泡+MSC組最高，見圖1。

表3 三組大鼠心功能情況比較()

表3 三組大鼠心功能情況比較()

圖1 三組大鼠心臟M型超聲圖像比較

圖2 三組大鼠心肌Tunnel染色

2.4 三組大鼠心肌組織學結果

Tunnel染色結果：PBS組Tunnel陽性細胞計數較MSC組、超聲微泡+MSC組增多，超聲微泡+MSC組Tunnel陽性細胞計數較MSC組減少，見圖2。

2.5 三組大鼠心肌bax與bcl-2蛋白表達變化

三組大鼠的bax蛋白、bcl-2蛋白以及bcl-2/bax表達水平比較，差異均有統計學意義(F=9.333，F=7.962，F=29.514；P＜0.05)，見表4。

表4 三組大鼠心肌bax與bcl-2蛋白水平比較()

表4 三組大鼠心肌bax與bcl-2蛋白水平比較()

bax蛋白以PBS組最高，bcl-2蛋白和bcl-2/bax以超聲微泡+MSC組最高，Western-blotting檢測各組大鼠心肌Bcl-2、Bax表達電泳見圖3。

圖3 Western-blotting檢測三組大鼠心肌bcl-2、bax表達

2.6 三組大鼠移植后MSC心肌歸巢陽性比率比較

三組大鼠移植前MSC心肌歸巢陽性比率相比差異無統計學意義(F=0.020，P＞0.05)。移植后24 h，PBS組、單純MSC組和超聲微泡+MSC組MSC心肌歸巢陽性比率均顯著高于移植前，差異有統計學意義(t=3.462，t=5.014，t=7.568；P＜0.05)。移植后24 h三組的MSC心肌歸巢陽性率比較，差異有統計學意義(F=166.411，P＜0.05)，見表5。

3 討論

阿霉素產生心肌毒性的機制主要包括自由基、線粒體損傷、細胞凋亡、阿霉素繼發性代謝物等，各種因素共同推動阿霉素心臟毒性的發生和發展[4]。陳飛等[5]研究表明，骨髓間充質干細胞移植可以改善心梗后心功能。超聲微泡介導可以顯著促進骨髓MSC歸巢，其機制可能與微泡空化效應使血管內皮細胞間隙增寬，毛細血管通透性增加，改善缺血心肌的灌注有關[5]。

表5 三組大鼠移植后MSC心肌歸巢陽性比率的比較(%，)

表5 三組大鼠移植后MSC心肌歸巢陽性比率的比較(%，)

本研究結果顯示，超聲微泡干預下，超聲微泡+MSC組毛細血管數量顯著多于PBS組，表明超聲微泡介導干細胞移植能夠更加有效地促進心肌缺血區新生毛細血管的新生，進一步改善因阿霉素導致心肌血液供給不足的狀況[5]。

MSC移植后可取代壞死的心肌細胞，分化為有收縮性的心肌樣細胞，從而改善壞死心肌彈性，限制阿霉素心肌病區室壁變薄[6]。本研究發現，左室舒張末期容積、左室收縮末期容積以超聲微泡+MSC組最??；室壁厚度、射血分數以超聲微泡+MSC組最大，表明在超聲微泡干預下，MSC移植可改善阿霉素心肌病的收縮功能，可能是MSC的新生細胞增加了心肌收縮力及改善心肌重構，與陳飛等[5]研究結論相似。

阿霉素能夠通過促進bcl-2表達下調、bax表達上調引起心肌細胞凋亡，bcl-2/bax比值升高，bcl-2與bax形成異源二聚體時，則可以阻止bax蛋白的促細胞凋亡作用[7-8]。本研究發現，超聲微泡+MSC組的bax蛋白表達水平顯著低于其他組，bcl-2、bcl-2/bax蛋白表達水平顯著高于其他組，表明超聲微泡干預介導MSC移植能夠增加bcl-2表達，降低bax表達，抑制阿霉素導致的心肌細胞凋亡，從而改善阿霉素心肌病大鼠心功能。本研究發現，移植后24 h MSC心肌歸巢陽性比率以超聲微泡+MSC組最高，表明超聲微泡介導MSC移植的歸巢特性明顯，大部分MSC均成活，并且逐步分化為心肌細胞，從而提高SD大鼠心肌自我修復能力。

5 結論

超聲微泡介導干細胞移植對阿霉素心肌病治療效果明顯，在超聲微泡干預下，MSC移植可改善阿霉素心肌病的收縮功能，可能是MSC的新生細胞增加了心肌收縮力及改善心肌重構，有利于促進心肌細胞再生，改善因阿霉素心肌梗死而受損的心功能。