雷公藤紅素對人子宮內膜癌HHUA 細胞增殖、周期及凋亡的影響

李詩婷，郭玲通訊作者，龔琴琴，蔣澤梅，甘建妮，李俊霞，張永萍，徐劍

(貴州中醫藥大學藥學院制劑實驗室，貴州 貴陽)

0 引言

子宮內膜癌是原發于子宮內膜上皮的女性生殖器官惡性腫瘤，其發病率和病死率近來年均有上升趨勢[1]。雖然目前針對子宮內膜癌的診斷和治療手段不斷發展，但其總體療效不佳，病人承受很大痛苦。研究開發療效更加顯著的腫瘤治療方法仍是醫藥工作者亟需解決的醫學難題之一。雷公藤紅素，是從衛矛科植物雷公藤、南蛇藤植物中提取的五環三萜類單體化合物[2]，是雷公藤及其制劑包括雷公藤片、雷公藤多苷片的主要有效活性成分之一。其作為一種天然蛋白酶抑制劑[3]，能有效抑制蛋白酶體活性和誘導細胞凋亡，對前列腺癌[4]、肺癌[5]、肝癌[6]、白血病[7]、膠質瘤[8]、結腸癌[9]、卵巢癌[10]、乳腺癌[11,12]等多種腫瘤細胞均產生了顯著的抗腫瘤活性。然而，目前尚未見雷公藤紅素用于治療子宮內膜癌的研究報道。本文擬選擇人子宮內膜癌HHUA 細胞為研究對象，考察雷公藤紅素對人子宮內膜癌細胞增殖、周期及凋亡的影響，為將其開發為子宮內膜癌治療藥物提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Olympus BX5 型生物顯微鏡( 日 本Olympus 公 司)；MCO-17AC 型二氧化碳培養箱(日本Sanyo 公司)；YDS-35-125 型液氮罐( 成都液氮容器廠)；BD-100LT 型低溫冷凍柜(青島海爾電冰柜有限公司)；SW-TJ 型水平流凈化工作臺(蘇州市凈化設備總廠)；AQZX-C 型空氣浴振蕩器(哈爾濱市東明醫療儀器廠)；Allegra X-22R 型高速冷凍離心機(美國Beckman Coulter 公司)；Varioskan Flash 型酶標儀( 美國Thermo Fisher Scientific 公 司)；CytomicsFC500 型 流 式 細 胞儀(美國 Beckman Coulter 公司)。

1.2 藥品與試劑

雷公藤紅素( 成都普菲德生物科技有限公司，批號：18032109，純度：＞98.0%)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、核糖核酸酶A(RNAse A)溶液、碘化丙啶(PI)、0.25%胰酶(北京索萊寶科技有限公司)；AnnexinV-FITC/PI 雙染試劑盒(美國BD 公司)；1640 培養基、青鏈霉素雙抗(廣州吉尼歐生物科技有限公司)；胎牛血清(美國 GIBCO 公司)。

1.3 細胞株

人子宮內膜癌HHUA 細胞株購自廣州吉尼歐生物科技有限公司，由本實驗室保種。

2 方法

2.1 細胞培養

HHUA 細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的1640 培養液中，于37 °C、5% CO2培養箱中培養。用0.25%胰酶消化細胞進行傳代，每周約3 次，隔天更換一次培養基，取對數生長期細胞用于實驗。

2.2 細胞增殖實驗

采用MTT 法檢測雷公藤紅素對HHUA 細胞增殖的影響。取對數生長期的HHUA 細胞，計數后按每孔5 000 個細胞接種于96 孔板中，待細胞貼壁長至80%匯合度時，小心棄去培養基，加入不同濃度(0.1、0.4、1.4、6.4、25.6 μg/mL)的雷公藤紅素培養基溶液進行干預，每孔200 μL，同時設置空白組(無細胞)和對照組，每組設5 個復孔。培養36 h 后，棄培養液，每孔加入200 μL 含0.5 mg/ mL MTT 的PBS 溶液，繼續孵育4 h。中止培養，吸盡孔內培養液，每孔加入200 μL DMSO，將培養板置于37℃±0.5 ℃空氣浴振蕩器中振搖15 min，使結晶物甲瓚充分溶解。于酶標儀上570 nm 處測定各孔的吸光值A，記錄結果。按以下公式計算細胞存活率：

細胞存活率(%)=[(A 加藥組-A 空白組)/(A 對照組-A 空白組)]×100%

2.3 細胞周期實驗

利用PI 染色法檢測雷公藤紅素對HHUA 細胞周期分布的影響。取對數生長期的HHUA 細胞，計數后按每孔300 000 個細胞接種于6 孔板中，待細胞貼壁并長至80%匯合度時，棄去培養基，以1.07 4 μg/mL 雷公藤紅素處理細胞，同時用培養液作為空白對照組，每組設3 個復孔。培養36 h 后，用胰蛋白酶消化細胞，提取l mL 細胞懸液，于4 °C，2 000 rpm離心5 min，去除上清液后用預冷的75 %乙醇于4 °C 固定30 min，離心去除上清液，用PBS 洗滌，加0.3 mL PBS 重懸后加入0.l mL 0.1%Triton X-100 溶液室溫下孵育15 min 進行打孔。孵育后再加入0.1 mL 0.1 mg/mL 的RNaseA 酶，37 °C孵育30 min 降解RNA，然后加入0.2 mL 0.1 mg/mL 的PI 染色DNA，4 °C 孵育30 min 后用流式細胞儀測定各組細胞周期分布情況，并用 ModFit LT 2.0 軟件進行分析。

2.4 細胞凋亡實驗

采用AnnexinV-FITC/PI 雙染法定量評價細胞凋亡情況。取對數生長期的細胞，計數后按每孔300 000 個細胞接種于6 孔板中，待細胞貼壁并長至80% 匯合度時，棄去培養基，加入含雷公藤紅素1.07 4 μg/mL 的培養基溶液，同時用培養液作為空白對照組，每組設3 個復孔。加藥培養36 h 后，按Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒標準操作步驟進行染色，染色后樣品于1 h 內用流式細胞儀檢測分析。

3 統計學分析

采用Origin 8.0 軟件進行數據分析。數據均以均值±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析、t檢驗，*P＜0.05 差異具有統計學意義。

4 結果

4.1 雷公藤紅素對HHUA 細胞增殖的影響

MTT 結果如圖1 所示，雷公藤紅素對人子宮內膜癌HHUA 細胞的增殖呈現抑制作用，且具有明顯的濃度依賴性。雷公藤紅素處理HHUA 細胞36 h 后，細胞存活率的IC50 值為1.07 4 μg/mL，后續實驗均在該濃度下進行。

圖1 雷公藤紅素對HHUA 細胞增殖的影響。(A)不同濃度雷公藤紅素處理HHUA 細胞36 h 后，MTT 法測得的細胞存活率結果。(B)雷公藤紅素干預HHUA 細胞36 h 的IC50 值。

4.2 雷公藤紅素對HHUA 細胞周期的影響

如圖2 和表1 所示，雷公藤紅素作用HHUA 細胞36 h后，與0 μg/mL雷公藤紅素組比較，1.07 4 μg/mL雷公藤紅素組G0/G1 期細胞比例顯著增加，S 期細胞比例顯著減少(P＜0.05)。此外，當用雷公藤紅素處理后，藥物組不僅將細胞阻滯在G0/G1 期，同時還使得Sub G1 期細胞比例增加。

圖2 雷公藤紅素對HHUA 細胞周期的影響

4.3 雷公藤紅素對HHUA 細胞凋亡的影響

如圖3 和表2 所示，雷公藤紅素可顯著增加細胞早期凋亡和晚期凋亡率。與對照組比較，1.07 4 μg/mL 雷公藤紅素處理HHUA 細胞36 h 后，細胞凋亡率均顯著增加(P＜0.05)。

圖3 雷公藤紅素對HHUA 細胞凋亡的影響

表1 雷公藤紅素對HHUA 細胞周期的影響 (%，±s，n=3)

表1 雷公藤紅素對HHUA 細胞周期的影響 (%，±s，n=3)

注：與0 μg/mL 雷公藤紅素組比較，*P＜0.05。

組別 Sub G1 期 G0/G1 期 S 期 G2/M 期0 μg/mL 1.47±0.05 51.63±2.02 31.61±1.63 16.76±1.08 1.07 4 μg/mL 19.51±0.85* 62.73±1.27* 23.11±0.84* 14.16±0.78

表2 雷公藤紅素對HHUA 細胞凋亡的影響 (%，±s，n=3)

表2 雷公藤紅素對HHUA 細胞凋亡的影響 (%，±s，n=3)

注：與0 μg/mL 雷公藤紅素組比較，*P＜0.05。

組別 早凋亡 晚凋亡 總凋亡0 μg/mL 7.4±0.9 2.3±1.0 9.8±2.0 1.07 4 μg/mL 25.2±1.4* 12.7±1.5* 37.9±1.0*

5 討論

子宮內膜癌是女性生殖器官三大惡性腫瘤之一，占女性生殖系統惡性腫瘤的20 %-30 %[13]。雷公藤紅素是中藥雷公藤的主要有效活性成分之一，經查閱文獻發現，其不僅在抗炎、免疫抑制、抗神經退行性疾病等[14]領域顯示了良好的藥理活性，還在治療腫瘤等方面展示了其潛力，極具開發價值。研究發現雷公藤紅素對體外培養的女性生殖系統惡性腫瘤細胞包括宮頸癌細胞[15]和卵巢癌細胞[16]均有較強的抑制作用，并能誘導細胞凋亡。但雷公藤紅素對于子宮內膜癌的抗腫瘤作用至今尚未見報道。本實驗研究雷公藤紅素對子宮內膜癌細胞株HHUA 細胞的作用，探究臨床應用雷公藤紅素治療子宮內膜癌的可行性。

本實驗通過MTT 法觀察了不同濃度的雷公藤紅素(0.1、0.4、1.6、6.4、25.6 μg/mL)對人子宮內膜癌細胞株HHUA 的生長抑制情況，并與空白對照組進行比較，發現雷公藤紅素對HHUA 細胞的增殖呈現抑制作用，且具有明顯的濃度依賴性，在一定的濃度范圍內隨著藥物濃度的增加，抑制作用也顯著增加。

癌細胞的細胞周期處于失控狀態，這是癌細胞可以無限增殖的原因之一，抗腫瘤藥物可通過阻滯細胞周期抑制腫瘤生長[17]。雷公藤紅素可將HHUA 細胞周期相對阻滯在G0/G1 期，使G0/G1 期細胞比例顯著增加，S 期細胞比例顯著減少。此外雷公藤紅素還使Sub G1 期細胞顯著增多，Sub G1期代表亞二倍體DNA 的含量，象征著細胞凋亡，說明雷公藤紅素不僅產生了細胞周期阻滯作用，還誘導了子宮內膜癌細胞發生凋亡。因此，本課題進一步采用AnnexinV-FITC/PI 雙染檢測細胞凋亡情況。實驗結果表明，與對照組比較，1.07 4 μg/mL 雷公藤紅素干預HHUA 細胞36 h 后，HHUA 細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著增加(P＜0.05)。

綜上所述，本研究首次探索了雷公藤紅素對人子宮內膜癌HHUA 細胞的抗腫瘤作用，結果發現其體外抗腫瘤作用明顯，雷公藤紅素可能通過干擾細胞周期，誘導細胞凋亡進而抑制HHUA 細胞的增殖生長。后期筆者將建立動物模型，結合體內、體外實驗進一步深入探索雷公藤紅素對子宮內膜癌的治療作用，并探究雷公藤紅素阻滯細胞周期以及誘導細胞凋亡的分子機制，為其臨床應用奠定一定實驗基礎。