非小細胞肺癌患者血清CPA-4 及MMP-9 水平及臨床價值研究

劉朝富，林益坤，譚亞利，袁應化，廖文英

(解放軍海軍陸戰隊醫院，廣東 潮州)

0 引言

非小細胞肺癌(non-smallcell lung carcinoma，NSCLC)是臨床上最常見的呼吸系統惡性腫瘤，也是世界范圍內發病率最高的惡性腫瘤，造成了巨大的衛生及經濟負擔[1]。對NSCLC 的早期篩查診斷有助于提高根治性手術率，從而更好的改善患者預后，延長生存時間。血清無創腫瘤標志物在NSCLC 的早期篩查診斷中有重要的應用價值，便于針對高危人群進行篩查評估。雖然目前也有如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、神經元特異性烯醇化 酶(neuron-specific enolase，NSE)及細胞角蛋白19 可溶性片段(CYFRA21-1) 等的部分血清標志物在臨床上得到了應用，但是其針對NSCLC 的診斷準確度仍有待提高。羧肽酶A4(carboxypeptidase A4，CPA-4) 屬于金屬羧肽酶家族，作為一種分泌性蛋白，其主要由細胞分泌后參與催化羧基端氨基酸的釋放，從而參與腫瘤相關微環境的形成[2]。既往的研究也報道了在如乳腺癌、結直腸癌、肝細胞癌等惡性腫瘤中存在CPA-4 的異常表達，但在NSCLC中的表達情況還相對較少[3-5]?；|金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9) 屬于B 類明膠酶，其可以參與降解如明膠(I、Ⅱ、Ⅲ型)、彈力蛋白、層粘蛋白等，對多類惡性腫瘤的侵襲及轉移有重要的促進作用[6]。因此，本研究檢測了初治NSCLC 患者血清CPA-4 及MMP-9 的改變情況，并分析了兩項指標的臨床診斷效能，以求為篩選腫瘤診斷標志物提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料

納入2018 年3 月至2020 年6 月在解放軍海軍陸戰隊醫院住院的初治NSCLC 患者79 名(NSCLC 組)，平均(45.59±8.72)歲，性別比(男/女)為59/20。同時納入健康對照56 名(健康對照組)，平均(43.70±8.46)歲，性別比(男/女)為43/13。NSCLC 的診斷標準參考中國原發性肺癌診療指南[7]，所有患者在后期手術或組織活檢中經病理檢查確診為NSCLC。排除標準：①非初治NSCLC；②孕婦及兒童；③缺少病理檢查結果。

1.2 一般情況及常規實驗室檢查

所有NSCLC 患者在住院時記錄一般情況，包括性別、年齡、身體質量指數(bodymassindex，BMI)、吸煙史、家族史等，同時完善相關實驗室檢測及肺功能指標。所有NSCLC 患者常規行胸片、CT 檢查，存在肺外器官轉移的患者均由PETCT 檢查確定。所有患者均由手術、支氣管鏡或胸腔穿刺活檢取得組織標本并由病理檢查診斷為NSCLC?；颊叩腡NM 臨床分期根據檢測結果及文獻標準確定[8]。

1.3 血清CPA-4、MMP-9 的檢測

患者住院時采集外周血5mL，離心分離血清后分裝凍存于-20℃冰箱。檢測前將血清標本取出在室溫下復融，使用酶聯免疫反應檢測血清CPA-4 及MMP-9 水平。CPA-4 及MMP-9 檢測試劑盒均購自上海鈺博生物科技有限公司，檢測步驟按照試劑盒要求嚴格進行，每個檢測樣品設置2 個復孔。使用酶標儀(Thermo 公司生產的Multiskan FC 酶標儀)檢測OD 值(檢測波長設置為450nm)，根據標準曲線計算待測樣品濃度，結果取平均值。

1.4 統計學方法

使用SPSS 19.0 軟件統計分析數據，使用GraphPad Prism 5.0 軟件繪制圖形。計量資料使用均值±標準差(±s)表示，組間比較使用獨立樣本t檢驗；計數資料使用n(%)表示，組間比較使用χ2檢驗。相關性分析使用Spearman 相關法，診斷價值分析使用ROC 曲線，曲線下面積(area under curve，AUC)≥0.750 提示診斷價值較高。P＜0.05 表示差異具有顯著性。

2 結果

2.1 一般情況、CPA-4、MMP-9 及CEA 水平

患者一般情況、CPA-4、MMP-9 及CEA 水平如表1 所示。與健康對照組相比，NSCLC 組血清CPA-4(4.50±1.23 vs.0.95±0.48ng/mL)、MMP-9(33.90±10.59 vs. 13.67±4.19ng/mL)及CEA(63.82±27.08 vs.15.15±6.88ng/mL)水平更高，差異有統計意義(P＜0.001)。不同性別、家族史及臨床分期NSCLC 患者血清CPA-4 及MMP-9 水平如表2 所示。NSCLC 組中，存在遠處轉移(M1)患者血清CPA-4(4.98±1.28 vs.3.87±1.08，P=0.001) 及MMP-9(44.38±12.26vs.26.38±9.43，P＜0.001) 水平顯著高于無遠處轉移(M0)患者，差異有統計學意義(表2)。

表1 一般情況、CPA-4、MMP-9 及CEA 水平

表2 NSCLC 患者亞組CPA-4、MMP-9 水平(n=79)

2.2 血清CPA-4(MMP-9)與臨床指標的相關性分析

NSCLC患者CPA-4與腫瘤臨床分期(R=0.407，P＜0.001)、CEA(log10ng/mL)(R=0.477，P＜0.001)、MMP-9(R=0.338，P=0.002)呈顯著正相關，與年齡(R=0.152，P=0.246)、BMI(R=0.022，P=0.845) 無顯著相關性；MMP-9也與腫瘤臨床分期(R=0.469，P＜0.001)、CEA(log10ng/mL)(R=0.347，P=0.002) 呈顯著正相關，與年齡(R=0.053，P=0.642)、BMI(R=0.122，P=0.284)無顯著相關性。

2.3 CPA-4、MMP-9 及CEA 單獨或聯合診斷NSCLC的價值

血清CPA-4 水平單獨診斷NSCLC 的AUC 為0.829(95%CI：0.762～0.896)，當cut-off 值取為2.86ng/mL 時，診斷特異度為0.767，靈敏度為0.810，陽性預測值為0.829，陰性預測值為0.762，約登指數為0.577(圖1)。MMP-9 單獨診斷NSCLC 的AUC 為0.844(95%CI：0.777～0.912)，當cut-off 值取為17.89ng/mL，診斷特異度為0.804，靈敏度為0.772，陽性預測值為0.847，陰性預測值為0.714，約登指數為0.576(圖1)。CEA 診斷NSCLC 的AUC為0.812(95%CI：0.741～0.883)，當cut-off值取為19.36ng/mL時，診斷特異度為0.750，靈敏度為0.722，陽性預測值為0.811，陰性預測值為0.689，約登指數為0.472。CPA-4 聯合CEA 診斷NSCLC 的AUC 為0.872(95%CI：0.814～0.931)，MMP-9 聯合CEA 診斷NSCLC 的AUC 為0.879(95%CI：0.820～0.938)，CPA-4、MMP-9 及CEA 三項指標聯合診斷的AUC 為0.903(95%CI：0.851～0.956)(圖2)。

3 討論

在我國，NSCLC 的臨床發病率也呈逐年升高趨勢[9]。NSCLC 作為發病率最高的惡性腫瘤，患者早期常無顯著的臨床表現及體征，確診時常已出現進展或遠期轉移，導致NSCLC患者臨床預后較差，短期臨床病死率極高。對NSCLC 的早期篩查診斷，尤其是基于高危人群(高齡、吸煙、肺結核)的篩查有助于早期發現并給予根治性手術治療，從而最大限度的提高NSCLC 患者生存率，改善生活質量。血清腫瘤標志物作為一種無創簡便的檢測手段，在NSCLC 的早期篩查診斷中有著重要的應用價值，同時一些腫瘤標志物還可以用于NSCLC預后及療效評估。臨床上目前常用的腫瘤標志物包括CEA、NSE、CYFRA21-1 等，由于NSCLC 具有復雜的生物學特性，上述標志物的診斷評估效能也需要加以改進提高[10]。CPA-4及MMP-9 是參與惡性腫瘤微環境形成及影響腫瘤生物學特性的重要功能蛋白，探討兩項指標在NSCLC 中的表達改變情況及臨床意義有助于篩選更為優良的NSCLC 診斷評估指標。

圖1 CEA、MMP-9 及CPA-4 單獨診斷NSCLC 的ROC 曲線

圖2 CEA、MMP-9 及CPA-4 聯合診斷NSCLC 的ROC 曲線

本研究結果顯示，NSCLC 患者血清CPA-4 及MMP-9水平存在顯著的升高，且升高程度與TNM 分期、遠處轉移存在顯著相關性。同時，血清CPA-4 單獨診斷NSCLC 具有較高的準確度，而相關的研究方面，如Sun 等[11]的研究探討了CPA-4 用于NSCLC 患者(n=165)診斷及預后的臨床價值，結果顯示，NSCLC 患者腫瘤組織中普遍存在CPA-4 表達升高，且血清CPA-4 水平也存在著同步的升高。CPA-4 單獨診斷NSCLC 的AUC 可達0.781，特異度及靈敏度分別為0.70 及0.86。提示了CPA-4 用于NSCLC 診斷的重要臨床價值。在CPA-4 用于其他惡性腫瘤的診斷評估方面，如Sun 等[12]基于胃癌患者(n=100)的研究也顯示，胃癌患者腫瘤組織中存在CPA-4 的表達升高，且CPA-4 表達程度與腫瘤提及、分期、淋巴結侵襲及遠處轉移存在顯著相關性，高CPA-4 表達的患者遠期預后更差(P＜0.001)，Cox 分析顯示CPA-4 是胃癌患者不良預后的獨立危險因素(HR=1.965，95% CI：1.072～3.600，P=0.029)。在基于胰腺癌患者的研究中也發現，CPA-4 可以作為胰腺癌的診斷評估指標，胰腺癌患者血清CPA-4 水平顯著高于健康對照，且CPA-4 水平與TNM 分期、淋巴結侵襲及遠處轉移存在顯著正相關，CPA-4 診斷胰腺癌的AUC 可達0.783，診斷特異度及敏感度分別為0.90 及0.61[13]。

另一方面，研究結果也顯示了血清MMP-9 在診斷NSCLC時也具有較高的診斷價值。相關的研究方面，如Gong 等[14]完成的薈萃分析顯示，NSCLC 患者血清MMP-9 水平與腫瘤體積(RR=0.83)、臨床分期(RR=0.72) 及不良預后(RR=1.32)具有顯著相關性，提示了MMP-9 用于NSCLC 預后評估具有較高的價值。而Xu 等[15]的研究也發現，血清MMP-9 水平診斷NSCLC 的AUC 可達0.890，與CEA 及NSE 的診斷效能相近(AUC 分別為0.840 及0.800)，MMP-9 的cut-off 值取為15.30ng/mL 時，診斷特異度為80.56%，敏感度為87.10%，結果提示了血清MMP-9 用于診斷NSCLC 具有較高的臨床價值。此外，本研究結果還發現，與單個指標相比，聯合CPA-4、MMP-9 及CEA 診斷NSCLC 的準確度更高。指南也推薦在使用血清學指標篩查NSCLC 中使用多指標聯合來提高診斷的效能[7]。如最新的研究也顯示，胸苷激酶1(TK1)、CEA、NSE 及CYFRA21-1 等指標聯合診斷NSCLC 的準確度較單項指標更高，診斷的特異度及敏感度也得到改進，提示了多指標聯合模型的臨床應用價值更好[16]。而CPA-4 及MMP-9在多指標聯合診斷評估模型中的應用也值得進一步的探討及驗證。

綜上所述，本研究顯示血清CPA-4 及MMP-9 水平用于診斷初治NSCLC 具有較高的臨床價值，且多項指標聯合能夠顯著提高診斷效能。此外，研究也存在一定的不足之處，如缺少對指標的動態觀測和原位癌組織中CPA-4(MMP-9)的表達情況。下步的研究還需要針對這些不足加以改進提高，并在更為前瞻性的大樣本隊列中驗證兩項無創指標的診斷及預后評估效能，從而為臨床提供更優良的參考。