‘哈伯’南天竹組織培養和快速繁殖

張俊林 樊靖 胡玉春 楊浩 胡紹慶 沈柏春

摘要：為建立‘哈伯’南天竹組織培養和種苗繁育技術體系，以半木質化帶芽莖段為外植體材料開展植株再生研究。通過觀察對比試驗法、L9（34）正交試驗設計完全隨機法、極差分析、顯著性檢驗、LSD多重比較，探討了‘哈伯’南天竹組培的最適培養基配方。試驗結果表明：最佳誘導培養基為MS + 6-BA2.0 mg/L + IBA0.1 mg/L +蔗糖30 g/L，誘導萌動率71.77%，成活率85.51%；最佳增殖培養基為WPM +6-BA1.5 mg/L+ IBA 0.01 mg/L +蔗糖30 g/L，增殖系數6.3；最佳生根培養基為1/2 MS+ IBA 0.5 mg/L + NAA 1.0 mg/L+蔗糖20 g/L +AC 0.2 g/L，生根率97.63%；試管苗移入泥炭土：珍珠巖=3：2（V/V）混合基質中，移栽成活率96.67%。該試驗建立了高效穩定的組培快繁技術體系，得到的組培苗后代能夠穩定的保持母本優良性狀，為工廠化育苗提供了技術支撐。

關鍵詞：‘哈伯’南天竹；組織培養；種苗繁育；再生；增殖

中圖分類號：S688.4文獻標志碼：A論文編號：cjas20200300087

Nandina domestica‘Harbour Dwarf’： Tissue Culture and Rapid Propagation

Zhang Junlin1， Fan Jing1， Hu Yuchun1， Yang Hao1， Hu Shaoqing2， Shen Bochun1

（1Hangzhou Landscaping Incorporated， Hangzhou 31000， Zhejiang， China；

2Building Engineering College， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， Zhejiang， China）

Abstract： The aim of this study is to establish a system of tissue culture and seedling production for Nandina domestica‘Harbour Dwarf’. The stem segments of semi-lignified band buds were used as explants to conduct regeneration study. The comparative experiments， completely randomized orthogonal experiment design of L9（34）， range analysis， significance test and LSD multiply comparative analysis were used to discuss the optimal culture medium. The results showed that the highest frequency of shoot induction （71.77%） and survival rate（85.51%） were achieved on MS + 6-BA 2.0 mg/L + IBA 0.1 mg/L + sucrose 30 g/L. The highest proliferation coefficient （6.3） was obtained on WPM +6-BA 1.5 mg/L + IBA 0.01 mg/L + sucrose 30 g/L. Microshoots exhibited best rooting response on 1/2 MS+ IBA 0.5 mg/L + NAA 1.0 mg/L + sucrose 20 g/L + AC 0.2 g/L by producing the highest frequency of root formation （97.63% ）. Rooted plantlets were transferred to artificial mixture medium （peat： perlite=3：2.V/V） under the green house condition with the survival rate up to 96.67%. An efficient propagation system of Nandina domestica‘Harbour Dwarf’was established， and the plantlets could steadily inherit the character of parents. The present system provides technical support for large scale plant production.

Keywords： Nandina domestica‘Harbour Dwarf’； Tissue Culture； Seedling Production； Regeneration； Proliferation

0引言

南天竹（Nandina domestica）為小檗科南天竹屬常綠灌木[1]，是一種具有觀賞、生態、藥用等多種價值的樹種[2]，其葉、果、株型皆具極高的觀賞價值，廣泛用于園林綠化中[3-4]。南天竹原產中國華北、華中、華東及華南部分地區，日本亦有分布[5]，經過自然演化及栽培馴化已形成多個栽培變種，常見的栽培變種有紅果南天竹、玉果南天竹、五彩南天竹和藍果南天竹、狹葉南天竹、栗木南天竹和圓葉南天竹[6]，莖干筆直，高約2 m，少分枝或無分枝?！咸熘瘢∟andina domestica‘Harbour Dwarf’）原產地為美國北卡羅萊納州[7]，生長緩慢，株高40～80 cm，枝葉濃密，株形緊湊，基部萌蘗性強；葉片對生，2～3回羽狀復葉，偶有4回，小葉紡錘形，長4～8 cm，寬1～2 cm，先端鈍尖，基部楔形，全緣，薄革質，屬矮生類型南天竹新品種。

近年來，人們相繼對南天竹屬的不同品種展開了資源利用與開發[8- 9]、新優品種資源收集[10]、引種馴化[11-13]、播種育苗[14]、扦插繁育[15-17]、組培快繁等工作的研究，特別是‘火焰’南天竹（Nandina domestica‘fire power’）的相關研究報道較多。周南镚等[18]以‘火焰’南天竹莖段為外植體材料進行了組織培養和植株再生技術的研究；杜永芹等[19-20]在‘火焰’南天竹組織培養中通過篩選植物生長調節劑組合及使用濃度進行了研究了，取得了突破，提高了增殖系數；賈思振等[21-22]以‘火焰’南天竹組培苗葉片為外植體材料，建立了葉片不定芽再生技術體系且成功建立了遺傳轉化技術體系。

雖然有較多關于矮生型南天竹品種‘火焰’的組織培養技術研究報道，但鮮見‘哈伯’南天竹的組織培養報道。本研究以‘哈伯’南天竹半木質化莖段為材料進行組織培養技術研究，建立組培快繁技術體系，以期為工廠化育苗提供技術支持。

1材料與方法

1.1試驗時間、地點

本研究試驗于2016年3月—2017年12月在杭州市園林綠化股份有限公司組織培養技術實驗室（臨安）內進行。

1.2試驗材料

試驗材料為‘哈伯’南天竹（Nandina domestica‘Harbour Dwarf’）半木質化莖段，取自杭州市園林綠化股份有限公司苗木種質資源圃（臨安）。

1.3試驗方法

1.3.1外植體處理剪下當年生無病蟲害的半木質化枝條作為外植體材料，帶回實驗室。將枝條剪成長度2～ 5 cm的小段，保留葉柄長度0.5～1.0 cm，備用。將剪好的莖段用軟毛刷蘸取1%（V/V）的洗潔精溶液仔細刷除枝條污垢后，自來水沖洗60 min備用。將備用試材在超凈工作臺上用75%（V/V）酒精溶液浸泡45 s，無菌水沖洗3次，然后用1‰（m/V）升汞（HgCl2）溶液（添加幾滴吐溫-80）滅菌10 min，期間不斷震動；最后用無菌水沖洗6次，在無菌培養皿中用無菌濾紙吸干莖段表面水分。然后用無菌手術刀將莖段兩端各切去0.5～ 0.7 cm，兩側葉柄各切去0.2 cm，把處理好的材料切成1.0 cm左右的莖段，莖段形態學下端接種至誘導培養基上。

1.3.2誘導培養將處理好的莖段迅速接入含有0.1 mg/L吲哚丁酸（IBA）且添加6-芐氨基嘌呤（6-BA）（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mg/L）的誘導培養基上進行培養，誘導培養基以MS[23]作為基本培養基，卡拉膠7 g/L，蔗糖30 g/L，pH 5.6～5.8。每處理接種30瓶，每瓶接種1個外植體，重復3次；不添加生長調節劑的培養基作為對照（CK）。培養條件（文中無特殊說明均同此）：培養溫度（25±2）℃，光照時間12 h/d，光照強度60μmol/（m2·s）。以萌生嫩莖長度大于1 cm計為成活（有效萌芽），小于1 cm計為萌動，培養60天后，統計分析不同處理對‘哈伯’南天竹外植體萌動率和成活率的影響。

萌動率=（萌動數/未污染數）×100%…………（1）

成活率=（成活數/萌動數）×100%……………（2）

1.3.3增殖培養將誘導培養的長度小于0.5 cm的嫩莖直接轉接，大于0.5 cm的嫩莖（梢）切割成0.5～1.0 cm左右的莖段轉接到增殖培養基配方中。設置基本培養基[WPM[24]、1/2 MS（大量元素減半）、MS]、6-BA（0.5、1.0和1.5 mg/L）、IBA（0.01、0.05和0.1 mg/L）和蔗糖（20、30和40 g/L）4因素3水平，采用L9（34）正交試驗設計。每處理接種30瓶，每瓶接種5個嫩莖或莖段，重復3次。培養60天后，統計增殖倍數，并記錄增殖情況。1.3.4生根培養選擇生長健壯，高度大于1.5 cm的試管苗嫩莖進行生根培養，培養溫度（24±2）℃，光照時間12 h/d，光照強度60μmol/（m2·s）。采用以下8種培養基進行生根誘導：（1）1/2 MS；（2）1/2 MS+ 0.3 mg/L NAA；（3）1/2 MS+0.3 mg/L IBA；（4）1/2 MS+0.3 mg/L IBA + 0.3 mg/L NAA；（5）1/2 MS + 0.5 mg/L IBA + 0.3 mg/L NAA；（6）1/2 MS+0.3 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA；（7）1/2 MS+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA；（8）1/2 MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA；以上各培養基均添加2%蔗糖、7 g/L卡拉膠和0.2 g/L活性炭（AC）。每處理接種30瓶，每瓶接種10個嫩莖，重復3次。生根培養60天后，觀察生根情況并統計生根率，有效生根為嫩莖生根條數3條以上，根長2 cm以上。

生根率=（有效生根株數/生根總株數）×100%（3） 1.3.5煉苗移栽誘導生根苗根長2 cm左右時即可進行煉苗移栽。移栽前，溫室煉苗10天。用鑷子將小苗從培養瓶中取出，用清水洗凈根系，移栽到泥炭土：珍珠巖=3：2（V/V）混合基質的育苗床上，移栽完成后澆透定根水。移栽初期用塑料薄膜小拱棚保濕保溫，濕度80%以上，溫度保持在15～30℃之間，光照太強時適當遮陰。移栽小苗新根出現后每隔10天噴施1‰磷酸二氫鉀溶液；塑料小拱棚兩頭開口慢慢放風，進行環境適應性鍛煉，待小植株恢復健壯生長后就可移去塑料薄膜。移栽30天后統計成活率。

移栽成活率=（存活苗數/移栽苗數）×100%…（4）

1.4數據統計分析

采用Excel 2007和DPS 3.01專業版統計軟件進行數據分析及處理。

2結果與分析

2.1外植體誘導

將滅菌外植體莖段接種到誘導培養基中，接種后15天，外植體莖段葉柄開始松動脫落；除空白（ck）處理外，25天后莖段開始萌動；45天后腋芽伸長形成新梢。有些外植體莖段雖然萌動，卻不能抽生新稍，最終干枯死亡。

不同處理對外植體的萌動和成活有一定的影響，如表1所示。無生長調節劑的處理7（ck），無萌動和無成活；低濃度（0.5 mg/L）和高濃度（3.0 mg/L）的6-BA對外植體萌動不具有促進作用，萌動率較低；6-BA濃度為1.0～2.5 mg/L時，萌動率隨6-BA濃度增加先升高然后降低，當6-BA濃度為2.0 mg/L時，萌動率最高為71.77%；成活率總體呈現出與萌動率相似的變化現象，高濃度的6-BA抑制外植體抽生嫩莖，且影響嫩莖的質量，出現嚴重的玻璃化。綜上分析，適合‘哈伯’南天竹誘導培養的培養基為MS +2.0 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L IBA+蔗糖30 g/L（圖1A）。

2.2增殖培養基篩選

L9（34）正交試驗設計結果表明（表2），隨著培養基中6-BA濃度的增高，‘哈伯’南天竹試管苗的增殖倍數增加，由于基本培養基的不同表現出不同的長勢。處理3，即WPM+1.5 mg/L 6-BA +0.1 mg/L IBA+蔗糖40 g/L是最好的處理，增殖倍數最大為5.11，與其他處理具有極顯著性差異，生長勢表現良好。從極差分析結果可以看出，6-BA是影響‘哈伯’南天竹試管苗增殖倍數的主要因子（R=1.87），基本培養基對試管苗的增殖倍數影響也較大（R=0.88），IBA濃度的影響不大（R= 0.27），蔗糖用量的影響最?。≧=0.12）。以不定芽增殖倍數為參考指標，綜合考慮，優選出‘哈伯’南天竹試管苗的最佳增殖培養基配方為WPM+1.5 mg/L 6-BA+ 0.01 mg/L IBA +蔗糖30 g/L（圖1B），在此優選增殖培養基上培養，增殖率可達6.3以上。

2.3生根培養基篩選

選擇健康、莖段長度1.5 cm及以上的嫩莖接種于不同處理的生根誘導培養基上，其生根誘導效果表現不同的差異（表3）。植物生長調節劑對‘哈伯’南天竹組培苗生根誘導具有促進作用，不添加植物生長調節劑的處理1不生根，生根率隨IBA和NAA濃度增加而提高。組培苗誘導生根根系品質受IBA、NAA濃度及比例影響；處理2和處理3生根率差異不顯著，根系品質有較大差別，NAA誘導出的根系細長且柔軟，IBA誘導出的根系短粗且脆；處理4和處理5及處理6和處理7均有類似現象，且隨IBA濃度的增加，生根嫩莖愈傷變大；處理8生根率為97.63%，與其他處理有極顯著差異，根細品質好。綜合生根效果及根系品質優選，‘哈伯’南天竹最佳生根培養基為1/2 MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA（圖1C）。

2.4煉苗移栽

選擇根系較好的健壯植株移栽到泥炭土：珍珠巖= 3：2（V/V）混合基質的育苗床上，經過30天的移栽管理，移栽成活率96.67%，幼苗根系及植株生長良好（圖1D）。

3討論

3.1組培繁育的必要性

Meyer[7]報道指出‘Harbour Dwarf’南天竹于1956年發現，是一個以苗圃主人（Harbour C. L.）姓氏命名的南天竹栽培品種。其作為矮生類型新品種于2013年引種至浙江杭州，經過6年連續的區域適應性栽培試驗觀察發現，具有耐陰、耐寒、耐瘠薄、耐高溫，病蟲害極少；秋季氣溫轉涼，葉色轉紅（圖1E），尤其是冬季，葉色變為鮮紅（圖1F）的特性。該品種能適應我國絕大部分地區的氣候條件，秋冬變色效果尤以長江以北區域為最佳，是合適的園林景觀地被及色塊植物品種，亦可盆栽作為家庭園藝植物產品，具有廣闊的商業開發應用前景。

南天竹常規繁育主要采用扦插、種子播種及分株繁殖，由于‘哈伯’南天竹植株低矮、年生長量不大、莖節短的特性，無法獲得充足的扦插穗條用于扦插；偶有開花結實，果實自然脫落率極高，暫未收集到成熟果實。筆者所在的團隊通過扦插繁育試驗發現，‘哈伯’南天竹扦插比較容易生根，成活率較高，但受限于插條的數量，未能在短期內獲得大量種苗。植物組織培養技術恰好能打破因插條數量不足而造成的擴繁困難的窘境，一旦建立起完善的組培快繁技術體系，可快速繁殖種苗。

3.2外植體材料預處理

合適的外植體材料是取得組織培養成功的前提條件。取材時節、取材部位以及取材母樹的生長狀態對組培成功與否具有直接的影響。在本研究中發現，大田盆栽母本外植體材料消毒非常困難，多次試驗未能獲得外植消毒成功，主要污染為真菌污染，從葉鞘內長出菌絲，其原因可能是母本材料自身特性造成的，自然條件下植株節間極短，呈現出葉鞘抱莖互生狀，消毒劑不能徹底殺滅葉鞘內部的真菌，以及大田環境不干凈的原因，從而導致消毒失敗。2017年2月，筆者將大田盆栽轉移至溫室并進行平茬處理，半個月后植株莖基部陸續萌發新芽，為保證外植體取材的需求，保留2～3個新生嫩莖，其余萌芽全部抹除；為了加快生長速度以及增大莖段節間長度，間隔10天，噴施0.2 mg/L 6-BA和0.5 mg/L赤霉素混合液2次。4月中上旬新生枝條長度10～30cm，莖段直徑0.2cm左右，節間長度0.5～4cm。剪取此半木質化莖段作為外植體材料，進行和大田材料一樣的消毒處理，取得了消毒成功并建立了組培體系。所以，對于節間極短的繁育材料，可通過一定的技術處理使其快速生長，增加節間長度，從而降低外植體消毒難度。

3.3外植體誘導

影響植物細胞、組織和器官形態發生有諸多因素，其中植物生長調節劑的種類和濃度是主要因素[25]，外植體的誘導萌芽主要受植物生長調節劑的影響。試驗中以MS為基本培養基，添加2.0 mg/L6-BA和0.1 mg/L IBA，促進了腋芽的誘導，誘導率可達71.77%，且能激發外植體莖段2個腋芽同時萌發（圖1A），提高了外植體誘導率。在‘哈伯’南天竹莖段腋芽誘導試驗過程中發現6-BA誘導作用顯著，既能促進腋芽萌發，也適合萌芽嫩莖的生長，低濃度時萌發率較低，但過高濃度則抑制腋芽的萌發，同時有玻璃化現象出現，這與馬麗娜等[26]的報道相一致。生長素有助于緩解高濃度分裂素造成的玻璃化，這可能是誘導萌芽階段吸收了外源生長素，改變了分裂素/生長素比例的緣故，關于分裂素/生長素比例對外植體誘導的影響還需進一步研究。

3.4增殖培養

不定芽的誘導和增殖是植物組織培養再生體系建立成功與否的關鍵，而解決幼芽的增殖數量和速率是再生體系中重要的一步[27]。試管苗的增殖率受到生長調節劑種類及配比的影響，提高分裂素用量，會增加叢生芽數量，同時試管苗高度會降低，過高濃度使用時，從芽分化困難，甚至造成玻璃化，使用合適濃度的生長調節劑既可保證增殖系數又能分化出一定高度的嫩莖用于生根培養，省去壯苗培養環節，節省時間成本提高工作效率。本研究結果顯示，WPM +1.5 mg/L 6-BA+ 0.01 mg/L IBA是‘哈伯’南天竹較為適宜的增殖培養基，增殖系數6.3。確?？沙掷m性生產以及降低潛在的種苗后代變異的風險，工廠化生產過程中應降低6-BA的使用濃度到1.0 mg/L，瓶苗增殖系數控制在3～4為宜。

3.5生根誘導

以往研究表明大多數木本植物組培快繁存在誘導生根困難的問題[28，29]，這可能與培養基成分、激素種類、比例不同以及基因型有關[30]，通常采取調整生長調節劑種類及比例做進一步優化，提高誘導生根率，都明理[31]指出外植體誘導及增殖階段的培養條件影響試管苗本身激素水平和生長狀態，進而影響誘導生根；也有研究表明[32]，誘導生根率隨著繼代次數的增加而提高，本研究結果與其研究結論相類似?！咸熘裨谶B續繼代6次以后，生根誘導率明顯提高，由以前（繼代次數3～5次）的不足10%提高到50%左右；當繼代次數達到10次后，生根誘導率可達95%以上且呈現穩定狀態。推測可能的原因是隨著繼代次數的增多，增殖苗自身激素達到了利于生根的平衡狀態，關于試管苗內源激素隨繼代次數動態變化如何影響誘導生根率需要進一步研究。

4結論

本研究中以‘哈伯’南天竹半木質化莖段為外植體材料建立了組織培養及快速繁殖技術體系，實現了大規模工廠化生產繁育。最佳誘導培養基為MS + 6-BA 2.0 mg/L + IBA 0.1 mg/L +蔗糖30 g/L；最佳增殖培養基為WPM +6-BA 1.5 mg/L + IBA 0.01 mg/L +蔗糖30 g/L；最佳生根培養基為1/2 MS+ IBA 0.5 mg/L + NAA 1.0 mg/L +蔗糖20 g/L + AC 0.2 g/L。截止發表論文之時，通過此組培快繁體系繁育種苗200余萬株，盆栽和地栽種苗生長良好，沒有發現生長不良以及變異種苗。

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