不同標本類型檢測新型冠狀病毒核酸的臨床研究

鄧 傲，夏 雨，黃光成,2，費中海，許 媛,2，方 莉,2△

1.川北醫學院附屬醫院醫學檢驗科，四川南充 637000；2.川北醫學院醫學檢驗系，四川南充 637000

2019年12月底，湖北省武漢市持續開展流感及相關疾病監測，發現多起新型冠狀病毒感染的肺炎案例，新型冠狀病毒肺炎存在人傳人現象[1-3]。2020年1月12日，中華人民共和國國家衛生健康委員會將該病毒被命名為2019nCoV，將“新型冠狀病毒感染的肺炎”暫命名為“新型冠狀病毒肺炎”，簡稱“新冠肺炎”，英文名稱為“Novel Coronavirus Pneumonia”，簡稱“NCP”。后來世界衛生組織宣布，將新型冠狀病毒感染的肺炎命名為“COVID-19”，國際病毒分類委員會聲明，將新型冠狀病毒命名為“SARS-CoV-2”。為比較不同標本類型的核酸檢測效果，本研究對川北醫學院附屬醫院2020年1月28日至3月4日檢測的1 851例標本進行研究，分析其不同標本類型的陽性檢出率。

1 資料與方法

1.1標本 收集川北醫學院附屬醫院2020年1月28日至3月4日所有SARS-CoV-2核酸檢測標本共1 851例，其中痰液標本419例，咽拭子標本1 358例，糞便標本74例。同時收集10例已確診的COVID-19患者相關資料，將其編號為202001-202010。

1.2試劑 提取試劑為上海之江生物科技股份有限公司核酸提取試劑Z-ME-0044，擴增試劑為上海之江生物科技股份有限公司的SARS-CoV-2三靶標核酸檢測試劑盒及實驗室檢測技術指南[4]推薦的引物探針，檢測位點為ORF1ab、N、E基因。

1.3儀器 核酸提取儀器為上海之江生物科技股份有限公司EX3600半自動核酸提取儀，實時熒光PCR擴增儀為上海宏石醫療科技有限公司全自動醫用PCR分析系統SLAN-96P。

1.4方法

1.4.1標本前處理 咽拭子標本：取咽拭子頭部放入含3 mL病毒保存液的病毒保存管中，置于振蕩儀上振蕩混勻備用；痰液標本：根據痰液黏稠程度，吸取約500 μL痰液于3 mL病毒保存管中，反復顛倒振蕩混勻備用；糞便標本：用一次性拭子蘸取黃豆大小糞便于3 mL病毒保存管中，反復顛倒振蕩混勻靜置備用。

1.4.2核酸提取 取300 μL預處理后的待測標本加入核酸提取板的裂解液孔，同時在裂解液孔中加入20 μL蛋白酶K、6 μL RNA助沉劑、1 μL內標，放入半自動核酸提取儀中進行RNA提取。

1.4.3核酸擴增 擴增體系為19 μL PCR擴增液+1 μL Taq酶+5 μL模板。擴增程序為：45 ℃×10 min，95 ℃×30 s；95 ℃×15 s，58 ℃×30 s，45個循環。置SLAN96P實時熒光定量PCR擴增儀檢測，單點熒光檢測在58 ℃，熒光通道選擇FAM、HEX、ROX、CY5。FAM通道檢測ORF1ab基因，HEX通道檢測N基因，ROX通道檢測E基因，CY5通道檢測內參基因。

1.4.4結果判讀 結果判斷標準：在FAM、HEX、ROX通道中，若Ct值≤43，且擴增曲線呈典型的S型，則結果判讀為該通道檢測的基因陽性；若Ct值>43，或無數值，則該通道檢測的基因為陰性。在CY5通道中，若Ct值>43，則提示標本質量存在問題或者操作存在問題，需重新采標，進行標本提取并檢測。判斷結果如下：ORF1ab基因(+)且N基因(+)，則SARS-CoV-2陽性；單ORF1ab基因或N基因(+)，需要重復測定，仍為陽性，則判為陽性；ORF1ab基因、N基因均為(-)，則SARS-CoV-2陰性。

1.5統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件進行數據分析處理。計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1SARS-CoV-2核酸檢測結果分析 對1 851例SARS-CoV-2核酸標本檢測結果分析發現，3種不同標本類型陽性檢出率差異有統計學意義(P<0.05)，其中糞便標本陽性檢出率最高，為8.11%；痰液標本陽性檢出率次之，為5.49%。痰液標本與咽拭子標本陽性檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=496.19，P<0.05)；痰液標本與糞便標本陽性檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=241.43，P<0.05)；咽拭子標本與糞便標本陽性檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=1 151.30，P<0.05)。見表1。

表1 SARS-CoV-2不同標本核酸陽性檢出結果

2.210例已確診COVID-19患者的核酸確診標本類型分析 10例已確診COVID-19患者的核酸確診標本中，由痰液標本確診病例為7例，占比70.00%；由咽拭子標本確診病例為3例，占比30.00%；無糞便標本確診病例。

2.310例已確診COVID-19患者整個治療過程中各標本陽性檢測情況 分析10例已確診COVID-19患者在整個治療過程中所有標本類型核酸檢測陽性情況，痰液標本陽性病例占80.00%(8/10)，咽拭子標本陽性病例占70.00%(7/10)，糞便標本陽性病例占50.00%(5/10)。痰液標本聯合咽拭子標本陽性檢出率達到100.00%。見表2。

表2 10例已確診病例整個治療過程中各標本檢測情況

3 討 論

COVID-19是突發的、危及全球的公共衛生事件。流行病學調查發現，SARS-CoV-2的傳染源主要是感染SARS-CoV-2的患者和無癥狀感染者，同時家族聚集性病例的發現也預示SARS-CoV-2有人際傳播能力[5-6]。經呼吸道飛沫和密切接觸傳播是主要的傳播途徑，在相對封閉的環境中長時間暴露于高濃度氣溶膠情況下也存在感染的可能[7]。COVID-19傳染性強，供檢測的標本類型多樣，因此，快速鎖定標本檢測，提高檢測效率有助于控制其暴發流行和保障人民生命安全。

本研究對1 851例SARS-CoV-2標本檢測結果進行分析，糞便標本陽性檢出率最高，為8.11%，可能與其標本特性有關，其一是糞便標本送檢數少，僅有74例，占總數的4.00%；其二是糞便標本采集對象一般是確診患者或疑似患者。在1 851例中以咽拭子標本為主，川北醫學院附屬醫院的咽拭子標本主要來源于南充市周邊3個縣的疑似人員排查取樣，考慮到人員眾多且分散，故取樣以咽拭子為主。

分析10例已確診COVID-19患者的核酸標本類型發現，確診標本類型以痰液標本為主，占70.00%，而咽拭子標本僅占30.00%，無糞便標本確診。對比痰液和咽拭子兩種標本的檢測情況，該結果可能與SARS-CoV-2優先侵襲感染下呼吸道細胞有關[1]，進而產生的分泌物主要附著在痰液中，更易被檢出。陳煒等[8]的研究提出，痰標本的病毒載量高于咽拭子，檢出效果更優，預示對于早期感染SARS-CoV-2的患者其痰液標本更能提高SARS-CoV-2的確診率，咽拭子標本可能存在漏診情況。在對疑似人群進行篩查時除檢測咽拭子標本外，盡可能同時檢測痰液標本。

在10例已確診COVID-19患者整個治療過程中，痰液標本陽性病例最多，占80.00%，咽拭子標本次之，占70.00%，糞便標本占50.00%。糞便標本陽性率達50.00%應予以重視，同時，有患者在整個治療過程中痰液標本/咽拭子標本一直是陰性而糞便標本陽性的情況(202005、202009)。在對感染SARS-CoV-2的患者出院檢測及出院后隨訪檢測時，除了檢測痰液和咽拭子標本外，還應注重糞便標本的檢測。吳冰珊等[9]的研究表明，有55.56%的確診患者可排出SARS-CoV-2病毒，與本研究結果基本一致。比較10例COVID-19患者整個治療過程所有標本類型的檢測結果發現，痰液標本和咽拭子標本聯合檢測時陽性檢出率達100.00%，結合糞便標本的特殊性，是否可以在COVID-19患者治療過程中同時送檢痰液、咽拭子和糞便標本作為其療效監測和出院實驗室診斷還有待進一步研究。

綜上所述，本研究認為，在對疑似感染SARS-CoV-2人員的2次篩查排除時，最好同時送檢痰液和咽拭子標本，減少假陰性情況發生。在COVID-19病例實驗室確診、療效監測及出院實驗室診斷時，以咽拭子標本核酸檢測陰性作為排除感染及治愈標準在實施過程中需謹慎，最好采取痰液、咽拭子和糞便標本同時檢測，并嚴格把控COVID-19患者分泌物的處理，嚴防病毒外漏。