核酸適配體在環境與食品檢測中的應用進展

佟雨珊, 高志賢, 周煥英, 閆宏遠

(河北大學公共衛生學院， 河北保定 071002)

1 前言

核酸適配體是一段DNA(脫氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)序列，通常是利用體外篩選技術——指數富集的配體系統進化技術(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，從核酸分子文庫中得到的能夠與轉移配體特異性結合的單鏈寡核苷酸序列〔1-4〕。核酸適配體這一概念最初是由Ellington和Szostak提出的〔1〕，而后Ellington利用SELEX技術成功篩選出了能夠與汽巴克隆藍、活性藍4特異性結合的RNA，命名為aptamer。 核酸適配體可以由人工合成，與靶物質特異性結合，具有與抗原-抗體反應類似的高親和性和高特異性〔5〕，因此又被人們稱為“化學抗體”。但實際上核酸適配體在很多性能方面超越了抗體，具有很多獨特的優點如可進行體外篩選、應用范圍廣泛、對靶分子具有極高的分辨率、對實驗具有極高的重復性、精確性和純度、便于保存等優點，近年來已成為檢測領域的一項新的熱點，已經被廣泛應用到食品安全、環境監測、生物組裝、藥物遞送、信號轉換等多個領域。本文主要就核酸適配體近幾年在環境和食品檢測方面的應用進行總結、探討和展望。

2 核酸適配體在食品安全檢測中的應用

食品安全問題一直是人們關注的焦點，是衡量人民生活質量、社會發展水平和國家經濟建設的一個重要方面〔6〕。然而日益加劇的食品安全問題也在很大程度上給人們帶來了嚴重的危害。近年來，世界范圍內食品安全事件頻發，食品安全儼然成為一個引起全球性關注的焦點問題。從我國近幾年出現的食品安全抽檢不合格的情況可以看出，我國食品安全問題主要集中于致病菌、重金屬、生物毒素、農藥獸藥等幾個方面。針對食品中有害污染物，發展簡便快捷、靈敏可靠且高通量的現場快速檢測新技術是進一步加強食品安全工作的重要保障〔7〕。近年來，核酸適配體技術的快速發展引來了越來越多的學者關注，納米科學在食品安全檢測領域有著巨大的潛能。

2.1 致病菌的檢測致病性細菌直接或間接污染食品和水源，人經口感染可導致腸道傳染病的發生及食物中毒以及畜禽傳染病的流行。食源性致病菌是導致食品安全問題的重要來源。常見的是食品致病菌有痢疾桿菌、致病性大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀菌、金黃色葡萄桿菌、致病性鏈球菌等。目前一些傳統的檢測方法多是采用微生物培養、平皿計數等，這種方法還需要培養、分離，比較費時費力，檢測速度慢、效率低。近年來逐漸興起的DNA探針、核酸適配體技術也加入到食品安全檢測的隊伍中，這種技術選擇性高、特異性強，針對不同的致病菌有不同的適配體，結合電化學傳感器可實現快速、簡便、可靠的檢測手段，具有很高的重現性、穩定性和準確性〔8〕。 2011年Li〔9〕等篩選出大腸桿菌K88毛蛋白的核酸適配體以來，核酸適配體用于大腸桿菌的檢測已成為研究的熱點。Wu〔10〕等人使用了大腸桿菌O157:H7外膜特異性的兩個不同的適配體。其中一個適配體用于磁珠富集，另一個作為該病原體的信號報告體，用等溫鏈置換擴增(SDA)擴增，并進一步用橫向流動生物傳感器檢測，檢測到O157:H7大腸桿菌低至10個菌落形成單位(CFU)。不需要提取DNA，減少了處理和更簡單的設備要求，使該檢測方法成為一種簡單和快速的傳統方法的替代。Zhang〔11〕等基于核酸適配體特異性識別技術和納米離子增強拉曼信號原理，構建了對鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌進行同時檢測的拉曼核酸適配體生物傳感器，最低檢測限達15，35 CFU/ml。

2.2 毒素的檢測毒素是由生物體產生的，極少量就能引起人和動物中毒的一種物質。按來源可分為動物毒素、植物毒素、微生物毒素。微生物毒素又分為細菌毒素、真菌毒素和單細胞藻類毒素。毒素對食品安全的各個環節危害極大，加強對其檢測很有必要〔12〕。其中真菌毒素最為常見，廣泛分布在農作物中，通過食物進入人體，引起各種中毒癥狀。 Zhisong Lu〔13〕等人利用核酸適體探針及其互補的ssDNA修飾金納米粒子，構建了一個基于DNA折紙的黃曲霉毒素B1檢測平臺，為DNA折紙技術在多種小分子檢測中的應用開辟了新的視野。Cruz-Aguado〔14〕等篩選出一條針對赭曲霉毒素A的單鏈DNA適配體，用具有很高的特異性，可用來建立多種檢測方法檢測農產品中的赭曲霉毒素A。Qian〔15〕等人基于AuNPs在還原劑存在下促進AgNPs化學沉積，結合DNA適配體的堿基互補原則構建了一種雙通道多功能比色檢測技術，利用雙氧水催化TMB顯色反應使其具有更高的吸光度，并用以檢測黃曲霉毒素B1。他的這種方法操作簡單、成本低、省時省力，在初篩中具有很好的應用前景。

2.3 藥物殘留的檢測食品中的藥物殘留包括植物產品中的農藥殘留和動物產品中的獸藥殘留，Kim〔16〕等利用DNA適配體固定化金電極芯片，建立了一種用于化學傳感的電化學檢測方法。當17beta-雌二醇與DNA適配體相互作用時，結合的雌二醇干擾了亞鐵氰化物和亞鐵氰化物氧化還原反應產生的電子流，電流降低。在陰性對照實驗中，由于其他化學物質的存在，電流僅輕微下降。Liu〔17〕小組根據目標分子和分子信標競爭結合核酸適配體的原理，設計了一種三螺旋開關，由兩條帶有特定序列的DNA探針及目標物適配體形成一種發夾結構，當目標物啶蟲脒存在時，結構發出熒光，當啶蟲脒不存在時，熒光發生猝滅。該方法證實檢測線性范圍是100～1200 nmol/L，并成功應用到卷心菜樣品中。許景月〔18〕等以核酸適配體作為識別元件、以插入型染料噻唑橙作為信號元件構建了一種非標記核酸適配體傳感器檢測四環素。在最優反應條件下,該核酸適配體傳感器對TET進行檢測的線性范圍為0.05-1000 μg/m L,檢出限為0.022 μg/m L。這種非標記核酸適配體傳感器對食品中的其他獸藥殘留、乃至其他有害物小分子均具有很好的應用前景。

3 核酸適配體在環境衛生檢測中的應用

在經濟快速發展的時代背景下，環境污染惡化問題也逐漸顯露出來，當我國從農業大國向工業強國轉變的時候，越來越多的工業活動對自然界生態環境產生著不可逆的改變，全球變暖、土壤沙化、水資源污染、空氣質量下降等都成為世界范圍內不可忽視的重要方面。在環境保護問題上，我國始終走在世界前列。面對這些近在咫尺的環境問題，對工業廢氣、廢水進行有效的檢測檢驗，保證企業處理廢水、廢氣達到國家允許排放的標準顯得尤為重要。

3.1 重金屬檢測在各種環境污染中，重金屬污染已經成為最嚴重的環境生態污染之一，某些有毒重金屬對人體危害極大，同時又屬于累積性污染物，需要格外地引起重視。DNA適配體技術在重金屬檢測中有很大的發展。 Liu〔19〕設計了高選擇性識別Pb2+和Hg2+的DNA探針，與凝血酶連接的適配體探針(TBA)5’端和3’端分別標記熒光供體羧基熒光素和熒光受體4-〔4-(二甲胺基)苯基偶氮〕苯甲酸，TBA在溶液中保持一個自由的線狀結構，當加入靶標物Pb2+和Hg2+后構相發生改變，這種構相的改變，使兩端的熒光基團和猝滅基團之間發生熒光共振能量轉移熒光強度下降，通過這種熒光強度的變化選擇性的檢測Pb2+和Hg2+，檢測最低濃度達到300 pmol/L和5.0 nmol/L，可用于土壤Pb2+和水中的Hg2+的檢測。 Li〔20〕等發現不同金屬離子與單標記核酸鏈的結合動力學存在差異性 ，首次根據其動力學特征來區分不同的金屬離子，將一端標記羧基熒光素的核酸鏈作為熒光探針，利用Cr3+的熒光猝滅動力學特征來檢測湖水中的Cr3+。該方法為核酸適配體在金屬離子的檢測中提供了新的思路。 袁敏〔21〕等設計了一種基于核酸適配體的電化學生物傳感器來檢測Cd2+，由于適配體與Cd2+有特異性結合能力，當鎘離子存在時與核酸適配體互補鏈競爭結合適配體，根據電化學信號的變化來進行檢測。此方法對Cd2+的線性檢測范圍為1.0 nmol/L～10.0 μmol/L，檢出限為65.1 pmol/L，是一種靈敏度高、特異性強的快速檢測方法，在鎘環境污染監測方面具有良好的應用前景。

3.2 農藥殘留檢測隨著農業生產的高度發展農藥廣泛使用，土壤、水環境中也容易出現殘留的農藥污染物，這些經過污染的水體不止存在自然界中，也會影響到我們的日常生活。目前核酸適配體的高特異性高靈敏度的分析檢測能力在環境安全監控中發揮著重要作用。 Bala〔22〕等將有機磷農藥的適配體與納米金連接形成一種光學傳感器，當目標殺蟲劑存在時，適配體構象改變，納米金顆粒聚集，溶液顏色發生改變，不僅肉眼可辨，檢測限可低至0.01 nM，且具有極高的特異性，當存在其它干擾物質時也可選擇性的識別磷酸鹽，從而成功應用于實際樣品的檢測。但農藥的種類繁多，我們生存的環境中需要檢測的農藥也并不單一，一種物質上可能存在好幾種農藥，高通量檢測是趨勢也是必然。2020年Liu〔23〕等研究建立了一種基于廣譜適配體的有機磷農藥比色檢測方法可以對不用類型的有機磷農藥進行分析檢測，在最優條件下，該方法可有效檢測50～1000 ng/ml的異碳磷和100～500 ng/mL的氧樂果。這種廣譜適配體可以實現農藥殘留的高通量檢測。

4 展望

目前，科技經濟的巨大發展為實現快速靈敏高效的檢測提供的更大的平臺，核酸適配體作為分子探針在檢測領域已經取得了一定的成果，其可塑性遠遠不止于此。隨著針對不同分子靶標的核酸適配體的出現，更多的基于核酸適配體檢測方法與檢測平臺也將被設計出來，也將產生更多高靈敏高特異性的檢測手段。相信隨著科技的不斷發展和廣大科研工作者的不懈努力，核酸適配體將在食品安全、環境監控、醫學診斷等領域發揮更大的作用。