鈉離子通道蛋白相關miRNA hsa-let-7i-5p 在房顫患者 冷凍球囊消融術前后表達變化及其臨床意義

宋遷甲，姚娟，燕建鋒，方舒，黃城

(1.新疆醫科大學研究生學院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區人民醫院心內科，新疆 烏魯木齊 830000；3.新疆石河子大學，新疆 石河子 832000)

0 引言

心房顫動(atrialfibrillation，AF，以下簡稱房顫)是近數十年來愈加熱門的心律失常疾病，現房顫的發病率不斷增高，老年人的房顫發病率可達3%-5%[1]，由于房顫常導致心衰和腦卒中，使住院率、病死率升高，小到家庭，大至社會均帶來了巨大的經濟和心理負擔。異常調控的離子通道蛋白引發的離子流重構和電重構是房顫發生發展的分子基礎，隨著醫療衛生技術的不斷更新進步，與房顫相關的miRNA 的研究引起了愈多的重視。雖有一些房顫射頻消融術后患者外周血及心房組織中miRNAs 表達水平的報道[2-3]，但關于冷凍球囊消融術的上述相關研究目前國內罕有報道，本文探討冷凍球囊消融術對調控鈉離子通道蛋白的miRNA 的影響和調控作用，分析與房顫發生發展相關的預警標志物，可能會為房顫的治療提供不同的思路與方向。報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

樣本取自于2017 年1 月至2019 年10 月在新疆自治區人民醫院心內科住院的陣發性房顫患者45 例，男35 例，女 10 例，年齡(57.8±9.6)。入選標準：(1)依據國內外通用的診斷標準[4]，根據病史、發病時癥狀、體征、ECG 或動態ECG 資料明確診斷陣發性房顫且接受冷凍消融術隨訪3 個月無復發者；排除標準：年齡＞75 歲，甲亢，糖尿病，血壓控制不良[收縮 壓＞140mmHg 和(或) 舒張壓＞90mmHg(1mmHg=0.133 kPa)]，左室功能減低(EF＜40%)，嚴重冠動疾病，肝、腎功能障礙，急、慢性感染疾病，心肌結構性病變?；颊呷虢M后均接受血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素受體抑制劑(ARB)、他汀類等藥物規范控制血壓、血脂等治療。停用β阻劑和其他抗心律失常藥物，后期隨訪房顫復發者予以排除。對照組為同病區無房顫的患者15 人，男10 例，女 5 例，年齡(59.0±10.0)。本研究經我院倫理委員會審核批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 標本采集

在實驗組中，患者在冷凍消融術前空腹下分別抽取4mL外周靜脈血，對照組同期抽取相同性質血樣4mL，分別置于EDTA 抗凝管中，2 h 之內分離血漿，1500 r/min，離心15 min，吸上清液至凍存管中，-80 ℃保存備用。對于術后轉復為竇律，期間無復發的手術患者在術后3 月后我科復診，按先前同樣條件下再次采取靜脈血保存。

1.3 主要試劑及儀器

TRhol Reagent 和miRNeasv mini 試劑盒、miRCURYTM Array Power Labeling kit 標記試劑盒、CIP 和CIP buffer 的混合物(1:1)、標記緩沖液、熒光探針(Hy3a、9、DMSO 和標記酶、總RNA 提取試劑盒(上海羽朵)，DEPC 處理水(無錫菩禾)，氯仿/無水乙醇(上海國藥)，SYBRGreen PCR 試劑盒(Thermo F-415XL)，逆轉錄試劑盒(Thermo #K1622)，紅細胞裂解液(無錫菩禾)、低溫冷凍離心機(Sigma 3K15)，Real-time 檢 測儀(ABI-7500)。

1.4 試驗方法

(1)提取RNA；(2)RNA 的提取及標記；(3)芯片雜交；(4)實時定量PCR(real—time PCR)；(5)靶基因預測：主要通過mirbase、miranda、targetscan 三大數據庫來進行miRNA 靶基因預測。利用Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes(KEGG)數據庫對預測結果進行信號通路歸類，然后根據GeneOntology project數據庫對靶基因參與的生化過程、細胞組分及分子功能進行分析。篩選所得靶基因至少存在于2 個數據庫中；(6)對預測的靶基因進行qRT-PCR 驗證。5 個選擇qRT-PCR 的基因引物序列如表1：

表1

1.5 統計學處理

數據輸入EXCEL 表格，并使用SPSS 23.0 軟件包完成。使用VolcnoPIot 法獲得差異表達，以病例組與對照組外周血比值＞1.5 倍認為是顯著上調，比值＜1.5 倍認為顯著下調，均用t檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 基線資料比較

在冠心病、糖尿病、高血壓、心力衰竭、卒中患病率對比中，實驗組明顯高于對照組，左房內徑(LAD)差異有統計學意義(P＜0.05)。在性別、年紀、吸煙、飲酒、體重質量指數(BMI)、左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室射血分數(LVEF)、BNP 方面差異無統計學意義(均P＞0.05)。詳見表2A、2B。

表2A

2.2 miRNA 表達譜

通過將結果與已知基因組進行比較并通過mirdeep2 軟件進行統計，可以獲得miRNA 表達定量，miRNA 表達閾值是將每組中的(Counts per million reads)CPM 平均值超過≥1 的miRNA 視為在該組中表達并進行統計分析。首先，設定閾值為1.5 倍差異，p-value ≤0.05 且組內CPM 均值≧1 來篩選差異表達miRNA，我們分析了整個AF 組(n=45)和SR(n=15)組之間miRNA 的表達。(圖A)散點圖、(圖B)火山圖、(圖C)聚類熱圖顯示了手術后與手術前對比miRNA 顯著差異表達的變化。

表2B

圖A

2.3 miRNA 靶基因預測結果

基于靶基因數據庫，分別對差異顯著上、下調的miRNA進行靶基因篩選，結果發現SCN5A 相關聯的miRNA hsalet-7i-5p 與房顫明顯相關，術前與術后相比明顯上調，此外，DAAM2 基因相關聯的miRNA hsa-miR-18b-5p、CLEC4G 基因相關聯的miRNA hsa-miR-1255a 也顯著上調，發現代表KCNA5(鉀離子通道相關基因) 的miRNA hsa-miR-4433b-3p 與房顫明顯相關，術前與術后相比明顯下調。

2.4 差異表達miRNA 的qRT-PCR 驗證結果

驗證選擇了代表調控鈉離子通道蛋白miRNA 的SCN5A基因進行了qRT-PCR 驗證，其中用內對照基因(管家基因 GAPDH)進行校正，進行相對表達量分析。qRT-PCR 結果顯示，與術前相比，術后SCN5A 的表達水平顯著上升，與測序結果相吻合。(*P＜0.05，**P＜0.01，與術前相比較)。如圖2A、2B。

3 討論

AF 的主要病理生理過程是心房重構，包括電重構、結構重構和細胞內Ca2+穩態異常[5]，近年來的研究認為，異常調控的離子通道蛋白引發的離子流重構和電重構是房顫發生發展的分子基礎，miRNA 參與心房電重構和結構重構。在AF的動物模型、房顫患者的心臟組織和血液中都有miRNA 的異常表達，且miRNA 表達調控能增強或減弱AF 的易感性[6]。SCN5A 基因位于3q21 人類染色體并編碼心臟鈉通道 Nav1.5蛋白，主要存在心肌細胞中，該通道蛋白負責鈉離子內向電流的峰值，影響心房、心室細胞和特殊傳導組織(浦肯野細胞等)的興奮性和傳導、再極化、晚期鈉離子通道[7]。國外有科研表明，AF 發作時，AF 患者右心耳的SCN5A／Nav 1.5 表達降低和峰值鈉電流密度降低[8]。Zhao、Huang 等研究者發現在房顫患者心房組織中miR-192-5p 上調，SCN5A 基因表達下調[9]。Daimi 等人發現，miR-219 能正向調控SCN5A 的基因和蛋白表達[10]。有研究分析，對比房顫組、對照組以及房顫復發組研究對象的外周血miRNAs 表達水平發現，有25 種miRNAs 在消融復律術后表達減少或増多[11]。此外，miRNA能抑制不完全互補的靶基因，一種miRNA 可以調節多個靶基因，多種miRNA 又可共同調節同一個靶基因[12]。結合本研究，在預測差異表達的miRNA 靶基因時，基于靶基因數據庫，分別對顯著差異上、下調的Top 10 miRNA 進行靶基因篩選，hsa-let-7i-5p miRNA 提示顯著上調，推測其可能與SCN5A基因、SLC1A4 基因、IGF1R 基因相關聯，隨后采用qRTPCR技術驗證SCN5A 在術后較術前明顯上調，符合上述說法。

圖B

圖C

圖2A

圖2B

隨著年齡的增長，房顫的發生率逐年上漲，即房顫的發生與年齡的增長呈正相關[13]，針對房顫的治療，藥物治療為先推薦的手段，然而在治療過程中，有些患者藥物治療效果差或不能耐受藥物相關作用，故消融技術應運而生并不斷發揚光大，導管消融術成為上述人群的優選治療方案。目前常用治療房顫的消融手段為射頻消融術(RFCA)和冷凍球囊消融術(CBA)，而CBA 作為一項新技術，較RFCA 學習快捷，操作簡單且術后相關并發癥少，目前越來越多的的城市將其納入醫保范圍，發展前景光明。在本研究中，通過對比發現，hsalet-7i-5p 在術后顯著上調，采用qRT-PCR 技術驗證靶基因，結果與預測相符，可能機制為hsa-let-7i-5p 的調控使術前房顫的易感性增加，在術后使離子流和電活動發生了逆轉。此外，DAAM2 基因相關聯的hsa-miR-18b-5p、CLEC4G 基因相關聯的hsa-miR-1255a 在本次研究中均顯著上調，但上述基因目前與鈉離子通道是否有明確聯系，目前國內外罕見相關文獻報道，需進一步證實。

綜上所述，本研究發現，miRNA hsa-let-7i-5p 在房顫患者接受CBA 前后的表達及其含量變化可體現其與房顫有著千絲萬縷的聯系，hsa-let-7i-5p miRNA 可能通過對SCN5A基因的調控，參與AF 的電重構，由于SCN5A 是心臟動作電位產生的關鍵，是抗心律失常治療的靶點[14]，因而miRNA hsalet-7i-5p 可能對于未來房顫的治療具有意義。但本實驗局限是只對比了陣發性房顫手術病人樣本，在不同房顫類型中miRNA hsa-let-7i-5p 表達和含量變化是否相同，尚不明確。此外，本研究沒有進一步行功能學實驗，若想進一步了解及證實miRNA hsa-let-7i-5p 對SCN5A 編碼鈉通道的功能學作用，仍需更深層次的探索，如電生理及動物實驗，對房顫發病機制的調控，治療的分子靶點的研究有重大意義。