外泌體源性miRNAs在結直腸癌中的研究進展

龔 婷，王正根

結直腸癌（colorectal cancer,CRC）是世界上三種最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有120萬新發病例和50萬死亡病例[1]。早期CRC患者的5年生存率接近90%，如果早期確診有被治愈的可能，且早期診斷和早期治療可以顯著提高CRC患者的總生存率[2]。結腸鏡檢查有較高的診斷率，但因檢查不便且具有侵入性，可能引起相關并發癥而將其限制在二級預防中。目前的篩查方法，如糞便隱血實驗（fecal occultblood test,FOBT）、糞便免疫化學試驗都有各種局限性，只有30%-40%的患者在早期被發現[3]。癌胚抗原（carcino embryonic antigen,CEA）是一種傳統的血清生物標志物，用于監測CRC復發，但由于其低靈敏度和特異性，并不是合適的診斷性生物標志物。外科手術、放化療及靶向治療在結直腸癌的治療方面均有一定進展，但治療效果欠佳。因此，發現具有高靈敏度和特異性的血清生物標志物以促進CRC的早期診斷、治療及預后評估是有必要的。外泌體miRNAs是腫瘤細胞微環境中信號交流的重要媒介，幾乎參與腫瘤發生發展的整個生物學過程。本文就外泌體miRNAs在CRC中的發生發展、診斷、治療及預后評估等方面進行綜述。

1 外泌體簡介

1.1 外泌體的生物學特征 外泌體是由正?；虬┳兗毎募毎ぱ苌哪遗?，大小在30 nm-100 nm[4]、40 nm-100 nm[5]、50 nm-150 nm[6]不等，釋放入如功能性細胞外液（血液、淋巴液及組織液等）、膽汁、母乳、尿液和唾液等各種體液中[7]。外泌體中富含多種生物活性物質，包括核酸（如miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA）、蛋白（如融合蛋白、膜轉運蛋白、熱休克蛋白）、脂質（如膽固醇、磷脂）等，其成分不同取決于源細胞的功能狀態[8]。有多種機制參與外泌體的釋放過程，其中最主要的機制是多囊體與細胞膜融合。釋放的外泌體可通過直接融合、受體-配體融合或受體介導的內吞作用等方式被受體細胞吸收[9]。大部分進入靶細胞內的外泌體將被溶酶體所降解以供細胞代謝所需，僅有小部分的外泌體釋放出內容物，并以此介導細胞間的通訊。外泌體介導的細胞間通訊主要有以下三種方式：①外泌體膜蛋白與靶細胞膜蛋白相結合，激活靶細胞信號通路；②在細胞外基質中，蛋白酶切割外泌體膜蛋白，然后與細胞膜上的受體結合以激活細胞膜細胞內的信號通路；③外泌體膜可直接與靶細胞膜融合，刺激外泌體源性蛋白質、mRNA和microRNA的非選擇性釋放[10,11]。有研究[12-14]表明，轉移前生態位的形成依賴于腫瘤來源的外泌體。外泌體的功能取決于它們來源的細胞類型[15,16]，不同細胞類型來源的外泌體具有不同的功能。腫瘤來源的外泌體參與腫瘤細胞和基質細胞之間的遺傳信息交流，導致大量新生血管形成，促進了腫瘤的生長和侵襲[17,18]。

1.2 外泌體miRNAs微小RNAs（miRNAs）是一類長度為18-22個核苷酸單鏈的非編碼RNA，轉錄后調節基因表達及控制各種細胞機制，包括各種腫瘤發生和發展[19-21]。miRNA代表了研究最多的非編碼RNA類，負責調節高達60%的蛋白質編碼基因表達[22]。miR?NA其中一個最重要特征在于其多靶點潛力，例如單個miRNA靶點多達200個mRNAs，而不同的miRNA可以調節相同的mRNA靶點[23]。外泌體miRNAs作為腫瘤基質-腫瘤細胞間信號交流的重要媒介，幾乎參與了腫瘤發生發展的整個生物學過程[24,25]。血清外泌體miRNAs豐度較高、穩定性好，且更容易標準化，有望成為CRC早篩早診、病情監測、療效評估的新型生物標志物[26,27]。相關研究[28]表明，外泌體miRNAs在血液循環中能穩定存在的有以下原因：①外泌體納米級別的直徑大小可以避免被吞噬；②外泌體本身攜帶CD47、CD55和CD59等分子，可避免被循環單核?巨噬細胞清除而穩定存在；③miRNA具有囊泡膜保護，可免受體液中的酶類物質降解[29]。

2 外泌體miRNAs與CRC的發生、發展及轉移

近年來很多研究表明外泌體miRNAs在CRC發生發展中扮演著重要角色。Bigagli E等[30]研究顯示，外泌體miR-210高表達能減弱細胞間的相互作用及增強細胞遷移和侵襲性，這可能是促進結腸癌上皮-間質轉換（epithelial-mesenchymal transitions,EMT）的機制之一。miR-92a是致癌miR簇miR-17-92的成員，位于染色體13q13，該區域促進細胞增殖、抑制癌細胞凋亡、誘導腫瘤血管生成，并加速CRC的進展[31]。Zhang G等[32]研究顯示外泌體miR-92a在CRC中顯著上調，導致E-cadherin下調及β-catenin和vimentin上調，從而通過PTEN（phosphate and tension homology de?leted on chromsome ten,PTEN）/胞內磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide 3’-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（ser?ine/threonine-specific protein kinase,Akt）途徑與其靶標PTEN的相互作用參與調控EMT，PTEN是目前發現的第一個具有脂質磷酸酶活性的抑癌基因，在腫瘤發生發展中具有重要作用。miR-200c是miR-200家族的成員，主要參與調節CRC細胞中鋅指結構轉錄因子中的E盒結合鋅指蛋白（zinc finger E-box-binding pro?tein，ZEB），誘導miR-200c抑制ZEB1的表達，從而減少CRC細胞的侵襲和遷移[33]。PROX1可通過與前miR-9-2啟動子結合抑制上皮鈣黏蛋白編碼基因表達，從而促進EMT[34]。叉頭框（forkhead box，FOX）轉錄家族的兩個成員FOXQ1和FOXM1是miR-320c的靶點，其參與EMT誘導過程。

外泌體miR-21作為致癌miRNAs，通過PTEN/PI3K/Akt信號通路下調大腸癌中PTEN的表達[35]。Bhome R等[36]使用小鼠模型研究顯示外泌體miR-21從腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblast,CAF）轉移到癌細胞增加了癌細胞的轉移潛力，這歸因于這種miRNA對不同的腫瘤抑制基因（如PTEN和PDCD4）具有抑制作用。Asangani I A等[37]報道稱miR-21通過PDCD4 3’-UTR中的nt228-249-CDR的特定結合位點，負調控腫瘤抑制因子PDCD4，并促進CRC的侵襲和轉移。失活的let-7a與高水平的KRAS、c-MYC及CRC的發生有關[38]，而let-7 KRAS rs712多態性與CRC風險增加相關[39]，鼠類肉瘤病毒癌基因途徑的激活可以觸發并上調某些致癌miRNAs（如miR-210、miR-181a、miR-200c），其在CRC發生發展和轉移中起關鍵作用[40]。Sun D等[41]研究表明miR-31可通過直接識別RAS p21 GTP酶的3’-UTR的特定位置激活RASA1轉錄，促進CRC細胞的生長并刺激腫瘤發生。外泌體的間接作用也被描述為免疫系統的負調節因子，如骨髓源性抑制細胞、調節性T細胞和單核細胞。這些細胞有利于腫瘤逃脫免疫監視[42,43]。Takano Y等[44]研究表明CRC來源外泌體能夠在體內啟動肝臟轉移前生態位的形成，并提出由CRC細胞釋放的外泌體miR-203，由單核細胞內化，從而促進M2標記的表達。這表明外泌體miRNAs的可能參與單核細胞分化為M2-腫瘤相關巨噬細胞[45]。Wang X等[46]研究表明，CRC細胞釋放的外泌體可能激活SDF1介導的基質細胞向肝臟生態位的趨化作用。這表明外泌體miRNAs通過招募表達CXCR4的細胞，包括免疫細胞、內皮細胞、成纖維細胞、骨髓來源細胞和干細胞，形成轉移前微環境，促進CRC的肝轉移。因此，在CRC的血清中檢測到外泌體miR-203的高表達是一個獨立的不良預后因素，與轉移潛能增加和生存期縮短相關[44]。外泌體miRNAs在CRC發生及演進過程中發揮著至關重要的作用，幾乎參與腫瘤發生發展的整個生物學過程。外泌體miRNA與CRC發生發展的具體機制有待進一步研究。

3 外泌體miRNAs在CRC臨床中的應用

3.1 外泌體miRNAs作為CRC診斷與預后標志物 腫瘤來源的RNA被包裝在外泌體磷脂雙層內可避免血清核糖核酸酶的降解，是腫瘤患者診斷和預后評估的生物標志物，目前這項技術被稱為“液體活檢”[47]。Chen X等[48]研究發現，CRC患者與健康人血清中的miRNA的表達水平是不同的，已經確定至少有69種miRNAs分子只能在CRC患者的血清中被檢測到。miR-21、let-7g、miR-31、miR-92a、miR-181b及miR-203這六種血清外泌體miRNA，已被證明是可靠的診斷CRC的生物標志物，與癌胚抗原（carcino embryonic antigen,CEA）和CA19-9等經典標志物相比，特異性和敏感性超過40%[49]。Ogata-Kawata H等[50]研究分析了CRC患者的血清外泌體miRNA，并將其與健康對照組進行了比較，鑒定出了16種差異表達的miRNA，包括：let-7a、miR-21、miR-23a、miR-150、miR-181b、miR-181d、miR-223、miR-483-5p、miR-638、miR-1224、miR-1229、miR-1246、miR-1268、miR-1290、miR-1308和miR-1915。進一步分析顯示miR-1246和miR-23a的敏感性最高，分別為95%及92%，是有希望診斷CRC的生物標志物。Vychytilova-Falte js?kova P等[51]在144例CRC患者和96例健康人群血清中發現54個miRNAs顯著下調，其中4個miRNA（miR-23a-3p、miR-27a-3p、miR-142p和miR-376c-3p）被確定為診斷性生物標志物，對早期CRC具有較高的鑒別能力（81%的敏感性和特異性，AUC=0.877）。Wang J等[52]研究證表明血清外泌體miR-125a-3p和miR-320c在部分CRC晚期患者中顯著上調，血清外泌體miR-125a-3p和CEA的聯合檢測著著提高了早期診斷CRC的能力。有些外泌體miRNAs通過靶向ZEB1和ZEB2轉錄因子調控EMT與腫瘤轉移相關[53]。Wang D S等[54]發現血清外泌體miR-103水平升高與淋巴結轉移和晚期腫瘤分期有關，反映了它參與了CRC的進展。其他血清外泌體miRNAs，如miR-506、miR-4316、miR-182和miR-30a-5p也已被認為是早期CRC檢測的潛在標志物[55-57]。Zhu M等[58]對來自196名CRC患者和138名健康人的血清樣本檢測中發現miR-19a-3p、miR-21-5p和miR425-5p的表達水平在CRC中顯著升高。因此，在中風險CRC人群中檢測這些血清外泌體miRNAs的表達水平可以作為一種篩查CRC的無創檢測方法。

據相關研究[59,60]報道，血清外泌體miR-200c、miR-203與EMT相關，具有很強的生物標志物價值，可作為CRC預后和預測轉移的指標。Tsukamoto M等[61]研究顯示血清外泌體miR-21是II-III期CRC患者DFS和OS以及IV期CRC患者總生存期（overall sur?vival,OS）的獨立預后生物標志物。血清外泌體miR-6803-5p高水平與CRC患者較短的無病生存期（dis?ease freesurvival,DFS）和OS顯著且獨立相關，在晚期患者及肝轉移患者中預測價值更高[62]。其他血清外泌體miRNAs（例如miR-17-92a、miR-92、miR-638、miR-19a、miR-548c-5p、miR-27a、miR-130a）被認為與CRC患者預后不良相關[63,64]。這些外泌體miRNAs血清水平升高與淋巴/血管浸潤或短期無進展生存期有關，有助于確定新的預后生物標志物，以早期識別腫瘤切除后復發風險高的患者[65-67]。這些都體現了血清外泌體miRNAs可作為CRC預后標志物，對CRC患者預后評估具有重要價值。

3.2 外泌體在CRC治療中的應用 外泌體miR-21的高表達與5-氟尿嘧啶的化療耐藥有關。Valeri N等[68]證明miR-21的過表達直接靶向抑癌基因突變體人類DNA MutS同系物2（hMSH2）的3'-UTR，并顯著下調其表達，從而顯著降低5-FU誘導的G2/M損傷阻滯和凋亡。Deng J等[69]進一步研究顯示miR-21過表達促進了細胞增殖和侵襲，抑制化療藥物5-FU對CRC HT29細胞的凋亡作用。外泌體miR-196b-5p的過表達也被認為是腫瘤干細胞通過靶向調節SOCS1和SOCS3（STAT3信號通路的兩個負調控因子）對5-FU耐藥的另一個標志[70]。Jin G等[71]研究發現了一組血 清 外 體miRNAs（miR-21-5p、miR-1246、miR-1229-5p及miR-96-5p），可以區分對常規化療敏感的CRC患者，敏感性為78%，特異性為88.90%。以上研究對外泌體miRNAs與CRC化療耐藥關系進行了闡述，為CRC的臨床治療提供了新的思路和靶點。外泌體具有運送貨物的生物學功能，Samanta S等[72]研究表明外泌體可以作為靶向藥物的載體，精準地破壞腫瘤細胞。Dai S等[73]對腹水來源外泌體（ascites exosome，Aex）與粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）聯合應用于CRC患者的免疫治療進行了I期臨床試驗。這種治療發方法可能是一種有益的、腫瘤特異性的抗腫瘤細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic tlymphocyte,CTL）反應，可能給晚期CRC患者免疫治療的提供新思路。Kamerkar S等[74]研究來自正常成纖維細胞樣間充質細胞的外泌體可攜帶特定siRNA或短片的細胞發夾RNA（sh-RNAs）到KRASG12D胰腺癌細胞，其在多種小鼠模型中被證明具有良好的抗腫瘤活性。Zhao H等[75]研究顯示癌癥相關成纖維細胞衍生的外泌體包含完整的代謝產物，包括氨基酸、脂質和三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle,TCAcycle）中間體。癌細胞利用CDEs的中心碳代謝促進腫瘤在營養缺乏的條件下生長，因此，抑制腫瘤外泌體的釋放或阻斷腫瘤的外泌體miRNAs的功能也可能成為治療CRC的新策略。

4 小結與展望

外泌體miRNAs是腫瘤細胞微環境中信號交流的重要媒介，幾乎參與腫瘤發生發展的全部生物過程。許多研究表明CRC中異常表達的miRNA通常與CRC發生發展或轉移相關。血清外泌體miRNA是一種很有潛力的診斷和治療CRC的生物標志物，然而，外泌體miRNA在CRC中的作用機制、早期診斷、靶向治療及預后評估等方面的研究仍具有巨大的挑戰。對其深入研究及將相關問題不斷完善，為發展優越的CRC篩查方法、治療靶點及預后標志物開辟新前景，為更好的臨床應用奠定基礎。