脂肪干細胞培養上清液對體外培養人臍靜脈血管內皮細胞的影響

閆靜川，王洪濤，賈艷慧，白曉智，劉 洋，陳俏華

已有研究[1]顯示，脂肪間干細胞（adipose derived stem cells,ADSCs）能夠促進創面愈合與組織再生。ADSCs具有多項分化潛能，可轉分化為多種修復細胞直接參與創面修復；另一方面，ADSCs可能通過旁分泌各種生長因子和免疫調節因子，調控創面炎癥反應，促進角質形成細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞的增殖和遷移，從而加速創面的愈合[2]，但具體機制尚不清楚。血管的發生是一個包含多種修復細胞、細胞因子、生長因子以及機械力學、氧濃度等微環境因素參與的復雜過程，低氧環境誘導、機械牽張、血管內皮細胞生長因子（Vascular endothelial Growth Factor,VEGF）、血管緊張素Ⅰ（AngiotensinⅠ,AngⅠ）、炎性因子等均參與這一復雜過程[3]。血管內皮細胞作為主要效應細胞，增殖、遷移等生物學特性在血管發生中發揮關鍵作用[4]。我們體外培養人ADSCs并收集培養上清液，作為條件培養基，觀察其對體外培養的人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）生物學特性的影響，初步探討ADSCs通過旁分泌促進血管發生的相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 游離脂肪組織由空軍軍醫大學第一附屬醫院燒傷外科提供，為全厚皮膚移植手術中修剪下廢棄的脂肪，經患者同意后自愿捐贈。HUVECs購自美國模式培養物庫，DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA購自美國GIBCO公司；Ⅰ型膠原酶、鼠抗人VEGF，AngⅠ抗體購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Corning公司；兔抗鼠熒光標記二抗、兔抗鼠酶聯標記二抗，β-actin多克隆抗體購自美國Abcam公司。倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；CO2培養箱、多功能酶標儀（Thermo公司，美國）。

1.2 ADSCs培養上清的收集 按照YAN LI[5]方法進行ADSCs的培養。簡單步驟為，在無菌條件下將大塊的脂肪用含1%雙抗的PBS反復沖洗三遍，后放入10 cm平皿中，剪成糜狀，加入0.1%Ⅰ型膠原酶，充分混勻后置于37℃恒溫箱，100 rpm消化40 min-60 min。100目鋼絲濾網過濾去除沒有消化的雜質，1000 rpm，離心10 min，棄去上清，用含10%胎牛血清的人ADSCs專用培養基5 mL重懸細胞沉淀，接種到25 cm2培養瓶中，置于孵箱常規培養和傳代。實驗選取3-5代細胞，待細胞長至75%-85%融合度時，PBS沖洗，無血清DMEM培養基饑餓培養24 h，收集上清備用，將上清與DMEM培養基按照1：1混合，并加入10%胎牛血清，作為實驗組條件培養基，含10%的胎牛血清的DMEM培養基為對照組。

1.3 HUVECs的復蘇和傳代 HUVECs來從液氮中取出細胞凍存管，立即置于37℃細胞復蘇水浴鍋中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養液，反復吹打混勻后1000 rpm離心3 min；棄去上清液后重懸，移至培養瓶中培養；待內皮細胞生長接近融合時用0.25%EDTA的胰蛋白酶溶液消化，傳代培養。

1.4 MTT增殖實驗 使用MTT測定法檢測細胞增殖，將HUVECs按每孔1×104接種到96孔板中，培養24 h、48 h、72 h后，分別向每個孔中加入20μL濃度為5 g/L的MTT并孵育4 h。棄去上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜并震蕩混勻15 min，490 nm波長酶聯免疫儀測取吸光度值。

1.5 劃痕實驗 將HUVECs接種于6孔板中，每孔1×105個細胞，待細胞80%鋪滿，PBS清洗2次，10μg/mL絲裂霉素37℃孵育1 h，用200μL吸頭在細胞培養孔中央垂直劃一直線，PBS清洗2次，分別加入實驗組和對照組培養基，于劃痕后即刻、24 h、48 h顯微鏡拍照，每次拍照固定相同位置，測量各時間點劃痕寬度，計算愈合速度，比較細胞遷移快慢。

1.6 Transwell遷移實驗 將Transwell小室插入24孔板中，向小室中加入100μL HUVECs 1×104/孔，置于培養箱培養1 h。實驗組下室更換為條件培養基，對照組下室更換為普通培養基，置于培養箱中繼續培養12 h。用棉簽刮去上室未遷移細胞，并將小室用多聚甲醛固定15 min，結晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察遷移細胞并計數，重復6次取平均值。

1.7 免疫熒光染色 將載玻片放入6孔培養板中，分別接種HUVECs 1×105個細胞/孔。待細胞70%融合后，PBS清洗2次，實驗組和對照組分別加入條件培養基和普通培養基，24 h后，PBS清洗，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%Triton/PBS室溫中處理15 min，甲醇新配置0.3%雙氧水室溫孵育15 min，5%BSA/PBS于37℃下封閉2 h，分別滴加1:100的鼠抗人一抗，4℃下孵育過夜，PBS洗滌×3次。1:50的Cy3標記兔抗小鼠二抗，37℃下孵育1h，PBS洗滌×3次，DAPI室溫孵育30 min，PBS洗滌×3次，防熒光淬滅封片劑封片后，顯微鏡拍照。

1.8 Westernblot 不同條件培養基培養條件下HU?VECs達到80%鋪滿時，RIPA強細胞裂解液作用30 min，后取上清液進行蛋白定量。取50μg總蛋白，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉膜至硝酸纖維素膜，用5%牛血清白蛋白封閉1 h。加入1:1000一抗工作液（VEGF、AngⅠ），4℃孵育過夜；加入1：2000辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的二抗，室溫下作用2 h?；瘜W發光法顯影，曝光。以相應蛋白條帶的積分光密度值，除以GAPDH的值表示目的蛋白的相對含量。

2 結果

2.1 MTT結果 與普通培養基相比，條件培養基在接種24 h、48 h和72 h，HUVECs增殖明顯增快，統計學差異顯著。見表1。

表1 不同培養基對HUVECs增殖的影響

2.2 細胞劃痕實驗 實驗結果顯示在第24 h和48 h，條件培養基細胞劃痕寬度明顯小于對照組，提示條件培養基可以促進HUVECs遷移。見圖1。

圖1 劃痕實驗檢測不同培養基對HUVECs遷移的影響

2.3 Transwell實驗 UVECs接種于Transwell小室培養12h發現，條件培養基組遷移至小室背面細胞數與對照組相比明顯增加。見表2。

表2 Transwell檢測不同培養基對HUVECs遷移的影響

2.4 免疫熒光染色 免疫熒光染色結果顯示，與普通培養基相比，條件培養基培養條件下的HUVECs表達VEGF和AngⅠ明顯增高。見圖2。

圖2 免疫熒光檢測不同條件培養基培養下HUVECs的VEGF、AngⅠ表達

2.5 Westernblot結果 Westernblot結果顯示，與普通培養基相比，條件培養基培養條件下的HUVECs表達VEGF和AngⅠ明顯增高。見圖3。

圖3 Westernblot檢測不同條件培養基培養下HUVECs的VEGF、AngⅠ表達情況

3 討 論

近年來，間充質干細胞在組織修復與再生中的作用日益受到重視。與其他干細胞相比，脂肪來源的間充質干細胞具有來源豐富、容易獲取等優點，具有更廣闊的臨床應用前景。研究[6]表明，ADSCs具有多項分化潛能，可以分化為內皮細胞，直接參與血管的再生，并有望用于缺血性疾病的治療。最近研究[2,4]顯示，干細胞真正在體內的轉分化作用是微乎其微的，無論自體或者異體局部注射干細胞大多數都以排斥清除的方式結束，干細胞的修復作用更多的是通過旁分泌及促進靶細胞的自分泌實現的。ADSCs可以通過旁分泌TNF-α，IFN-γ，TGF-β，VEGF等，促進新生血管的形成[7]。Lee EY等[8]研究發現，低氧誘導條件下，ADSCs能夠分泌低氧誘導因子1α（HIF-1α），與常氧條件下培養的ADSCs相比，誘導血管發生能力更強。Chen等[9]研究發現，ADSCs中分泌單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）、VEGF、血管緊張素等，均促進新生血管的發生。除此之外，ADSCs還能分泌一些免疫抑制因子、神經營養因子、細胞外基質蛋白、酶以及小分子核糖核酸mi?croRNA（miRNA）等[10]，這些成分不但可以促進細胞的增殖、分化和生存，還可以減少炎癥反應，提高修復速度和愈合質量[11]。近年研究[12,13]發現，ADSCs能夠分泌生物活性成分中含有一種50 nm-150 nm的顆粒，稱為外泌體（Exo），ADSCs-Exo外泌體中包含蛋白、脂質體、mRNA，miRNA等，而miRNA可能發揮了軸心作用，可以通過對靶細胞的調控發揮作用。外泌體化學性質穩定、生物安全性高、移植后無免疫排斥，是干細胞研究領域的新興熱點[14]。

血管的形成需要內皮細胞的增殖和遷移，以及內皮細胞、血管生成因子等與周圍蛋白之間的相互作用。在趨化作用下，內皮細胞穿透血管基底膜，侵入細胞外基質并形成管狀結構，繼續延伸，分支并形成網絡。VEGF/VEGF-R通路在這一過程中發揮重要作用，可以誘導相關基金表達，調控血管滲透性，促進血管內皮細胞增殖、遷移，抑制細胞凋亡[15]。我們通過提取ADSCs培養上清與HUVECs共培養，發現能夠促進體外培養的HUVECs增殖和遷移，并表達VEGF，AngⅠ等，初步闡明ADSCs可以通過旁分泌促進新生血管的發生。而由于ADSCs培養上清不含細胞成分，免疫原性低，無潛在致瘤性風險，克服了細胞治療臨床應用的局限性，且易于攜帶、轉運和保存，有望替代干細胞移植，形成臨床標準化治療方案。