雪膽多酚的穩定性及其對α-淀粉酶的抑制作用

段思宇 陳庚 高青青 郭兆寬 段柯兆 張廣輝 楊生超 趙艷

摘要：采用Folin-Ciocalte法測定雪膽中的多酚含量，研究金屬離子和溫度對多酚穩定性的影響，并分析多酚對 α-淀粉酶活性的抑制作用和抑制類型。結果表明，Mn2+、Fe2+、Fe3+和Cu2+對多酚具有破壞作用，其中Mn2+對多酚的破壞作用最顯著;溫度過高或者過低不利于多酚的保存，溫度在25～45 ℃多酚保存效果最佳;酶促動力學研究表明，雪膽多酚對α-淀粉酶具有抑制作用，其抑制作用類型為可逆競爭性抑制，表明雪膽具有開發為輔助降糖保健食品或藥品的價值。

關鍵詞：雪膽;多酚;穩定性;α-淀粉酶;抑制作用;金屬離子

中圖分類號： R284 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）09-0167-05

雪膽（Hemsleya chinensis）主要分布在我國西南地區的云南省和四川省[1-2]，具有清熱解毒等功效，可用于治療支氣管炎、細菌性痢疾和肺結核等[3]，具有很高的藥用價值，為常用傳統藥材[4-7]。多酚是一種次生代謝產物[8]，主要通過莽草酸和丙二酸途徑合成。植物多酚廣泛分布于植物的皮、根、葉和果肉中，大部分多酚類化合物為水溶性物質，存在于植物液泡中，天然存在形式較多。多酚類化合物是天然的抗氧化劑，除了有良好的抗氧化功能外，還具有保護植物免受紫外線傷害[9]、抑制細菌[10-11]等作用。多酚的酚羥基在光照等條件下容易被氧化，氧化后顏色加深。一些多酚物質能與 α-淀粉酶相互作用，從而抑制α-淀粉酶的活性[12]，這種抑制作用能有效阻礙食物中碳水化合物的水解和消化[13]。

近年來，國內外學者已對雪膽化學成分、藥理活性、作用機制等方面進行了研究[4，6-7，14-15]。植物中多酚具有良好的生物活性，已成為醫藥及食品領域的研究重點之一。然而，多酚在加工或貯藏等過程中，易受到溫度、光照和金屬離子等的影響而被降解，其抗氧化活性降低。α-淀粉酶是可以影響飲食中淀粉等主要碳水化合物消化和吸收的關鍵酶，抑制α-淀粉酶的活性能有效降低淀粉等物質的降解和葡萄糖的吸收，從而有效控制血糖的快速升高;因此，從中草藥的天然產物中獲得α-淀粉酶抑制劑已成為研究熱點。但有關雪膽多酚在貯藏過程中的穩定性和對α-淀粉酶抑制活性的研究還鮮有報道。因此，筆者對雪膽多酚的穩定性和雪膽多酚對α-淀粉酶抑制類型進行研究，旨在為雪膽多酚的保存和加工以及今后的綜合開發利用提供理論參考和依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

2018年7月雪膽塊莖采自云南柯兆生物科技有限公司的雪膽資源圃，其已由云南農業大學楊生超教授鑒定。試驗在云南農業大學西南中藥材種質創新與利用國家地方聯合工程研究中心完成。

所用試劑為α-淀粉酶（Sigma公司）、福林酚試劑、沒食子酸標準品、3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑、阿卡波糖，均為國產分析純。所用儀器為722N型可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）、電子天平[賽多利斯（上海）貿易有限公司公司]、RE-52AA型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）、數顯恒溫水浴鍋（上海雙捷實驗設備有限公司）。

1.2 雪膽多酚的提取及含量測定

將雪膽干燥塊莖經過粉碎過篩，通過回流提取獲得雪膽多酚提取液。根據Folin-Ciocalte法，在765 nm波長下測定提取液吸光度，建立標準曲線，計算雪膽總多酚濃度。

1.3 雪膽多酚穩定性試驗

1.3.1 金屬離子的影響 取20 mL多酚提取液加入比色管中，分別加入1、5、10 mg/mL Na+、K+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+、Al3+、Fe3+溶液 1 mL，每個處理3次重復，放置1 d后于765 nm波長下測定溶液吸光度。

1.3.2 溫度的影響 取30 mL多酚提取液加入比色管中，把比色管分別置于25～85 ℃下恒溫水浴 5 h，同一溫度下每隔1 h測定1次溶液吸光度，計算雪膽總多酚濃度和多酚保存率。

1.3.3 雪膽多酚保存率的計算 根據提取液處理前后的多酚濃度，計算雪膽多酚的保存率，計算公式如下：

1.4 雪膽多酚對α-淀粉酶的抑制作用

1.4.1 α-淀粉酶活性測定 取α-淀粉酶溶液，于37 ℃恒溫水浴放置15 min后，添加底物溶液 0.2 mL，混勻后添加 DNS試劑1 mL，于沸水浴中放置5 min，冷卻后添加蒸餾水15 mL，于540 nm波長下測定溶液吸光度。同時以磷酸鹽緩沖溶液作空白對照。

1.4.2 酶反應動力學進程曲線的建立 分別量取0.1～0.5 mL濃度為1 mg/mL的α-淀粉酶溶液于比色管中。隨后將比色管于37 ℃恒溫水浴中放置 15 min，添加底物溶液0.2 mL，混勻后添加DNS試劑1 mL，于沸水浴中放置5 min后及時冷卻，添加蒸餾水 15 mL，于540 nm波長下測定溶液吸光度。

1.4.3 雪膽多酚對α-淀粉酶的抑制效果 取 1 mg/mL α-淀粉酶溶液0.3 mL，分別添加不同濃度的多酚溶液1 mL?；旌弦夯靹蚝笥?7 ℃恒溫水浴中放置15 min，添加底物溶液0.2 mL、DNS試劑 1 mL，混勻后沸水浴5 min，及時冷卻并添加蒸餾水15 mL，于540 nm波長處測定吸光度;同時磷酸鹽緩沖溶液作空白對照，阿卡波糖作陽性對照，每個處理3次重復。計算雪膽多酚對α-淀粉酶的抑制率，公式如下：

1.4.4 雪膽多酚對α-淀粉酶的抑制機制 在底物濃度為0.5%的條件下，按照“1.4.1”節中的方法，以0.5 mg/mL為間隔，在540 nm下測定濃度范圍為0.5～2.5 mg/mL內的α-淀粉酶溶液的吸光度，并計算反應初始速率。以α-淀粉酶濃度和反應初始速率為橫縱坐標作圖，確定雪膽多酚提取液對α-淀粉酶的抑制作用類型（可逆或不可逆）。

1.5 數據處理及分析

以Excel 2013作圖分析，數據通過SPSS 20.0進行單因素方差分析（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 建立沒食子酸標準曲線

以濃度為0～9 μg/mL沒食子酸對應的吸光度繪制標準曲線。標準曲線線性方程：y=0.067 2x-0.062 7（r2=0.999 7）。

2.2 雪膽多酚穩定性分析

2.2.1 金屬離子對多酚穩定性的影響 不同金屬離子對雪膽多酚含量影響程度不同。由圖1可知，離子濃度的增大使含有不同金屬離子樣液的多酚含量出現變化，同時樣液顏色也有所改變。當雪膽多酚溶液中含有Na+、K+、Mg2+時，其多酚含量和顏色與空白對照組相比無明顯差別，可知這3類離子對多酚穩定性幾乎無影響。由觀察可知，Mn2+對雪膽多酚的影響最為明顯，Mn2+加入后，溶液立刻變得渾濁且有絮狀沉淀生成。Fe2+、Fe3+分別加入后，溶液逐漸變得渾濁，但無肉眼可見的沉淀產生。圖1表明，隨Fe2+、Fe3+離子濃度的增大，雪膽多酚含量逐漸增加，其中離子濃度為10 mg/mL時多酚含量的增加最顯著，表明高濃度Mn2+、Fe2+、Fe3+可能破壞了雪膽多酚結構;Cu2+加入后，樣液顏色明顯變化，但Cu2+的加入使多酚濃度減少，表明多酚結構可能被破壞，穩定性受到了影響。因此，雪膽多酚保存時，應盡量避免接觸Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+。

2.2.2 溫度對多酚穩定性的影響 如圖2所示，溫度對雪膽多酚含量變化有顯著影響。溫度為45～85 ℃ 時，隨加熱時間的延長， 多酚濃度整體呈下降

趨勢，且溫度越高多酚濃度整體下降趨勢越明顯。保溫5 h后，45、65、85 ℃條件下的雪膽多酚濃度降低，表明高溫條件下，多酚類物質化學及空間結構遭到破壞或降解。保溫5 h后，45、65、85 ℃條件下的雪膽多酚保存率依次為94.29%、91.95%、89.10%，推測高溫條件下多酚類物質化學結構遭到破壞或降解。保溫5 h后，25 ℃條件下多酚含量增加，原因可能是低溫抑制了部分酶的活性，減弱了氧化作用，能有效延緩氧化、聚合和降解。處理5 h后的樣液顏色變淺，推測這是由于多酚中呈色的花色苷類物質在熱處理下易氧化，且溫度越高，氧化速率越快。由此可見，在25～45 ℃時，雪膽多酚的熱穩定性較好。

2.3 雪膽多酚對α-淀粉酶的抑制作用

2.3.1 建立酶反應動力學進程曲線 通過建立不同α-淀粉酶用量的反應動力學進程曲線，確定能使酶反應初始速率達到最大值的最適酶量和最適反應時間。如圖3所示，隨著α-淀粉酶用量的增加，反應初始速率逐漸增快，綜合考慮酶量與反應時間的關系，確定最適酶量為0.3 mL，反應時間為3 min。

2.3.2 Km和Vmax的確定 以1/v和1/[S]為橫、縱坐標作圖， 得到α-淀粉酶的米氏方程曲線（圖

4），直線的橫縱截距分別表示1/Km的絕對值和 1/vmax。由此可以計算出米氏常數Km=11.628 mg/mL，最大反應速率vmax=0.137 mg/（mL·min），從而得到α-淀粉酶的米氏方程式：

由r2=0.998 4可知，該酶促反應與米氏方程較吻合，該方程也可用于對催化反應進行機理分析和應用性評價。

2.3.3 雪膽多酚對α-淀粉酶的抑制效果分析 測定0.60～6.00 μg/mL濃度范圍內的雪膽多酚和阿卡波糖對α-淀粉酶活性的抑制作用。由圖5可知，隨雪膽多酚濃度增大，抑制率呈現上升趨勢。

2.4 雪膽多酚對α-淀粉酶的抑制機制分析

2.4.1 抑制類型分析 以酶濃度和反應初始速率為橫縱坐標作圖，當存在可逆抑制劑時，速率直線過原點且斜率較低;當存在不可逆抑制劑時，速率直線不通過原點;當不存在抑制劑時，速率直線通過原點但斜率大于存在可逆抑制劑。如圖6所示，無抑制組直線的斜率大于抑制組直線的斜率且2條直線均通過原點，表明雪膽多酚對α-淀粉酶的抑制類型是可逆性抑制。

2.4.2 可逆性抑制類型分析 以抑制劑濃度和 1/v 為橫縱坐標作圖，當抑制類型為競爭性抑制時，不同底物濃度所對應直線相交但交點不在橫坐標上;而當抑制類型為非競爭性抑制時，兩直線相交且交點在橫坐標上;當抑制類型為反競爭性抑制時，則不相交。如圖7所示，底物濃度分別為0.5%、1.0%的2條直線相交但交點不在橫坐標上，說明雪膽多酚對α-淀粉酶活性的可逆抑制屬于競爭性抑制。

3 討論與結論

本研究從資源利用的角度出發，探討了金屬離子、溫度對雪膽多酚穩定性的影響。岳鑫的研究表明，溫度變化對紅松多酚的穩定性有顯著影響，并發現紅松多酚對光敏感，在金屬離子中Fe3+對其的破壞作用最為明顯[17]。仇洋發現低溫條件對黑果腺肋花楸多酚穩定性有利，同時發現受到Ca2+、Cu2+、K+等6種金屬離子影響，黑果腺肋花楸多酚穩定性被破壞，其中Cu2+的破壞作用最大[18]。楠極等在番石榴葉多酚穩定性的研究中表明，Zn2+、Fe2+和Fe3+均會影響多酚提取液的穩定性[19]。馬雙雙等發現蓮子殼多酚的穩定性受溫度和金屬離子的影響，其中Fe3+、Fe2+、Cu2+等6種離子對多酚的穩定性有顯著的破壞作用，溫度越高，降解程度越強[20]。在蘋果果皮和果肉多酚穩定性的研究中，同樣發現溫度越高，果皮、果肉中的總酚類物質含量越低[21]。由于多酚類物質具有抗氧化性[11]、抗衰老[22]、抑菌性[23]等功效，因此探討保存溫度、金屬離子等因素對多酚穩定性的影響，確保能夠最大程度地保存雪膽多酚避免損失具有重要意義。

本研究以可溶性淀粉為底物測定雪膽多酚對 α-淀粉酶活性的抑制作用，表明其抑制作用屬于可逆性的競爭性抑制類型。在黑果腺肋花楸多酚對 α-淀粉酶的抑制作用研究中，也發現隨著多酚濃度的上升抑制率增加，抑制類型屬于可逆非競爭性抑制[18]。柳梅等發現以沙棘葉為原料分離純化得到的提取物對豬胰α-淀粉酶具有一定的抑制作用，其抑制作用屬于可逆反競爭性抑制[24]。伍城穎等發現芡種皮多酚提取物對α-淀粉酶的抑制作用與濃度間存在量效關系，抑制類型為可逆性的競爭性抑制[25]。本研究探討了影響雪膽多酚穩定性的因素，以及對α-淀粉酶活力抑制的動力學研究，為今后雪膽多酚的開發利用提供了理論基礎，對于提高雪膽的附加值和雪膽資源的有效利用具有重要意義。

雪膽多酚抗Na+、K+、Zn2+、Mg2+和Al3+的干擾能力強，抗Mn2+、Fe2+、Fe3+和Cu2+的干擾能力較弱，特別是應盡量避免與Mn2+接觸;雪膽多酚對溫度較為敏感，溫度高于45 ℃，隨溫度升高和加熱時間延長，多酚保留率明顯下降，25～45 ℃多酚穩定性較好。雪膽多酚具有明顯的抑制作用，得到α-淀粉酶的米氏方程為v=0.137 mg/（mL·min）×[S]11.628 mg/mL+[S];雪膽多酚對α-淀粉酶活性屬可逆性抑制劑，其可逆抑制類型為競爭性抑制類型。研究結果可為雪膽多酚的保存和加工以及今后的綜合開發利用提供理論參考和依據。

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