未成熟卵母細胞體外成熟前后玻璃化冷凍的比較

施麗 公方強 莫毅 牛向麗

【摘要】 目的 比較人未成熟卵母細胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）前后玻璃化冷凍對卵母細胞的影響。

方法 318枚人生發泡期（germinal vesicle，GV）卵母細胞來自100名不孕癥患者，將患者隨機分為A、B兩組，每組50人。A組GV期卵母細胞玻璃化冷凍后解凍復蘇行IVM;B組GV期卵母細胞行IVM后玻璃化冷凍再解凍復蘇，比較兩組卵母細胞的解凍復蘇率、成熟率及24小時紡錘體出現率。

結果 兩組卵母細胞行IVM培養24小時及48小時成熟率比較均有統計學意義（P<0.05），卵母細胞解凍復蘇率、IVM培養24小時紡錘體形成率比較無統計學意義（P>0.05）。

結論 未成熟卵母細胞IVM后再行玻璃化冷凍保存效果更佳。

【關鍵詞】 玻璃化冷凍;未成熟卵母細胞;體外成熟;成活率;成熟率

中圖分類號：R321-33 ? 文獻標志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.07.004

【Abstract】 Objective To compare the effect of vitrification of human immature oocytes before and after in vitro maturation （IVM）.

Methods A total of 318 human germinal vesicle （GV） human oocytes were collected from 100 infertile patients， and the patients were randomly divided into group A and group B， with 50 cases in each group. The oocytes in the GV stage of the group A were vitrified and thawed before IVM， and the oocytes in the GV stage of the group B were vitrified and thawed after IVM. And then， the thawing recovery rate， maturation rate and 24-hour spindle formation rate of oocytes in the two groups were compared.

Results The maturation rates of oocytes cultured in IVM at 24 h and 48 h were statistically different between the group A and the group B （P < 0.05）， while there was no statistically significant difference in the thawing recovery rate of oocytes and the spindle formation rate after ? 24 h IVM culture between the two groups （P > 0.05）.

Conclusion Vitrification of immature oocytes after IVM is more effective.

【Key words】 vitrification; immature oocytes; IVM; survival rate; maturing rate

隨著玻璃化冷凍技術在輔助生殖領域的應用，成熟人卵母細胞玻璃化冷凍的成功率顯著增加[1～2]，玻璃化法已成為成熟卵母細胞冷凍保存的主要方法。國外學者研究證實未成熟卵母細胞體外成熟技術是有效的[3]，將未成熟卵母細胞的體外成熟和玻璃化冷凍相結合已成為癌癥患者化療前保存生育力的一種選擇策略[4];同時，未成熟卵母細胞玻璃化冷凍保存的成功將為卵子庫卵子的來源提供了新的途徑。理論上，保存未成熟卵母細胞有兩種可能的方法：未成熟卵母細胞體外培養成熟（in vitro maturation，IVM）后玻璃化冷凍保存和直接玻璃化冷凍未成熟卵母細胞[5]。學者們對于哪種方法冷凍保存未成熟卵母細胞后對卵母細胞的成熟及發育潛能影響較小尚存爭議。本研究旨在探討這兩種方法對人卵母細胞存活率、成熟率及發育潛能的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年3月至2017年3月在廣西壯族自治區生殖醫院行卵胞漿內單精子顯微注射（intracytoplasmic sperm injection， ICSI）的不孕癥患者丟棄的人生發泡期（germinal vesicle，GV）卵母細胞。納入標準：未成熟卵母細胞來自年齡小于35歲的患者，卵子形態正常，因男方因素行輔助生殖技術助孕，女方非全部卵子均不成熟。318枚GV期卵母細胞來自100名患者，將患者隨機分為兩組：A組50名患者，共142枚GV期卵母細胞，直接進行玻璃化冷凍，解凍復蘇后行未成熟卵母細胞IVM培養至成熟即第二次減數分裂中期（metaphase Ⅱ， MⅡ）;B組50名患者，共176枚GV期卵母細胞，IVM培養至MⅡ期后再行玻璃化冷凍。該研究通過了廣西壯族自治區生殖醫院倫理委員會的審查。

1.2 方法

1.2.1 未成熟卵母細胞的獲取

根據患者年齡或卵巢儲備功能選擇長效方案控制性超促排卵。黃體中期使用注射用醋酸曲普瑞林（益普生，法國）垂體降調節，采用重組人促卵泡激素注射液（Merck Serono，瑞士）和注射用尿促性素控制性超排卵。根據B超監測和血清雌二醇（estradiol， E2）水平適當調整藥物劑量，當2個主導卵泡直徑達18 mm時肌注人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin， HCG）6000～10 000 IU，36小時后取卵。卵冠丘復合物經透明質酸酶（SAGE，美國）處理脫掉大部分顆粒細胞后，在倒置顯微鏡下判斷卵母細胞的成熟情況，MⅡ期卵母細胞進入正常ICSI周期，318枚GV期卵母細胞用于本研究。

1.2.2 卵母細胞冷凍方法

玻璃化冷凍試劑盒（KITAZATO，日本）由平衡液（equilibration solution， ES）和玻璃化溶液（vitrification solution， VS）組成，使用前在室溫下平衡30分鐘。做每液滴20微升ES滴3滴（ES1、ES2、ES3）及20微升含20%血清蛋白替代品（SAGE，美國）的緩沖輸卵管液培養液1023（SAGE，美國）液滴1滴備用。漂洗去油后的卵母細胞首先移至備好的緩沖輸卵管液培養液1023液滴。1分鐘后將1023液滴與ES1連線，計時2分鐘;在1023與ES1連線的中點與ES2 再次連線，計時2分鐘，最后將卵母細胞移至ES3液滴放置。5分鐘后將卵母細胞從ES3中移至冷凍試劑盒的玻璃化溶液（VS）液滴中，準備裝載，在VS液中的總時間需大于90秒但小于120秒，每根載桿裝載不多于3枚卵母細胞，裝載后將載桿投入液氮中。

1.2.3 卵母細胞解凍復蘇方法

玻璃化解凍液（KITAZATO，日本）由解凍液（thawing solution，TS）、稀釋液（dilute solution，DS）和洗液1（washing solution-1，WS-1）及WS-2四部分組成。TS液使用前放入培養箱（不通CO2）中預熱1小時，DS、WS-1、WS-2液室溫下平衡1小時。從液氮中取出載桿，將裝有卵母細胞的載桿前端快速浸入TS中，把卵母細胞從載桿上洗脫，此過程不超過1分鐘。然后，將卵母細胞迅速移至DS中3分鐘，讓卵母細胞自然下沉，再將其轉移至WS-1中5分鐘，后將卵母細胞移至WS-2中5分鐘后，將形態完全恢復的卵母細胞轉入培養液中。A組GV期卵母細胞轉入IVM培養液中培養;B組MⅡ期卵母細胞轉入授精輸卵管液培養基（SAGE，美國）中培養。

1.2.4 IVM、紡錘體觀察

未成熟卵母細胞體外培養采用IVM MEDIA KIT試劑盒（SAGE，美國），按照說明添加促卵泡生成素（follicle stimulating hormone， FSH）和黃體生成素（luteinizing hormone， LH）至終濃度75 mIU/mL。未成熟卵母細胞在IVM培養液中培養24、48小時分別評估卵母細胞成熟情況，出現第一極體則判斷為MⅡ期，超過48小時沒有發育至MⅡ期的卵母細胞視為IVM失敗。A組卵母細胞玻璃化冷凍復蘇后在IVM培養液中培養24小時，用偏振光顯微鏡觀察MⅡ期卵母細胞的紡錘體;B組卵母細胞在IVM培養液中培養24小時后先用偏振光顯微鏡觀察MⅡ期卵母細胞的紡錘體，IVM培養液培養至48小時后玻璃化冷凍MⅡ期卵母細胞。實驗結束后將所有卵母細胞廢棄。

1.3 統計學方法

應用SPSS 25.0統計學軟件對數據進行統計學分析，率的比較采用卡方檢驗，兩樣本均數比較用t檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2 結 ?果

兩組GV期卵母細胞來源患者的年齡、BMI、竇卵泡數（AFC）、不孕年限及基礎FSH比較均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

本研究共318枚GV期卵母細胞，其中A組142枚，B組176枚。A組142枚GV期卵母細胞玻璃化冷凍解凍復蘇后有114枚存活。A、B兩組卵母細胞行體外成熟培養24小時及48小時成熟率（50.00%和63.07%，P=0.028;74.56%和86.36%，P=0.011）比較均有統計學意義;兩組玻璃化冷凍后卵母細胞解凍復蘇存活率（80.28%和84.87%，P=0.299）比較無統計學意義;兩組體外成熟卵母細胞24小時紡錘體形成率（78.95%和80.18%，P=0.851）比較無統計學意義。見表2。

3 討 ?論

未成熟卵母細胞包括生發泡期卵母細胞和第一次減數分裂中期（metaphase Ⅰ， MⅠ）卵母細胞兩大類，GV期卵母細胞的典型特征是含有1個巨大的生發泡，卵母細胞結構中有兩層大的細胞膜，即細胞膜和生發泡膜。在進行冷凍及復蘇過程中，兩層膜對滲透壓的變化有著較強的緩沖作用，且相對于成熟卵母細胞，GV期卵母細胞處于減數分裂的雙線期，尚未形成紡錘體，且紡錘體對溫度變化特別敏感，玻璃化冷凍容易導致成熟卵母細胞紡錘體損傷[6]，因此，理論上凍存GV期卵母細胞似乎是更好的選擇。

本研究結果顯示未成熟人卵母細胞在GV階段和IVM培養后MⅡ階段玻璃化冷凍復蘇存活率無顯著差異，這與FASANO[7]及HUANG[8]的研究結果一致。然而，與IVM后玻璃化冷凍組相比，卵母細胞在GV階段玻璃化后再IVM的卵母細胞成熟率顯著降低，與相關研究結果一致[9～10]。表明雖然兩種方法都能較好地保存卵母細胞的成活率，但結果提示未成熟期玻璃化冷凍降低了卵母細胞的成熟潛能[10]。未成熟卵母細胞在體外成熟前玻璃化的低成熟率可以通過觀察其超微結構的變化（如微絨毛層的減少、空泡化、線粒體囊泡復核物的增加和線粒體畫面內質網聚集體的改變）和應激及凋亡相關基因表達譜的增加來解釋[11]。而MOLINA等[12]的研究結果則顯示IVM前先玻璃化冷凍組卵母細胞成熟率高于先IVM后玻璃化組，該研究認為玻璃化冷凍保護劑二甲基亞砜的滲透作用導致細胞內鈣離子的瞬時升高，從而促進未成熟人卵母細胞體外成熟。DADDANGADIA等[13]的研究顯示在小鼠青春期前卵母細胞中，生發期玻璃化冷凍優于MⅡ期玻璃化冷凍，這一結果是否存在于青春期前人卵母細胞還需進一步研究。而最新一項研究則顯示無論未成熟卵母細胞是在IVM之前還是IVM之后進行冷凍保存，玻璃化冷凍存活率、成熟率都相當[14]。

在冷凍過程中，卵母細胞暴露于冷凍保護劑，紡錘體結構可能會保留，但在解凍過程中，紡錘體結構完全喪失[15～16]。然而，進一步的研究表明紡錘體在冷凍保存后有重新組裝的恢復能力[17～18]。偏振光顯微鏡的應用可無創地觀察成熟卵母細胞的紡錘體。國內學者呂愛香[19]的研究顯示在無卵丘細胞包裹的未成熟卵母細胞中，先IVM后冷凍對卵母細胞紡錘體的損傷較先冷凍再IVM要小。GARCIA-ORO[20]和MAHFOUDH [21]的研究表明觀察到紡錘體的卵母細胞正常受精率、卵裂率、優質胚胎率、囊胚形成率、妊娠率均顯著高于未觀察到紡錘體的卵母細胞。SHEN等[22]研究認為紡錘體可作為選擇新鮮人卵母細胞胚胎移植的重要指標，因為它們能反映胚胎發育潛能。因此，紡錘體可視化是預測更好的受精潛力、胚胎發育和臨床結果的重要工具[23]。VERSIEREN等[24]研究同樣也說明冷凍保存的GV期卵母細胞在變暖后顯示出減少和延遲成熟，但激活潛力不受影響。我們的研究結果顯示，在IVM前后玻璃化冷凍的未成熟卵母細胞體外成熟后24小時的紡錘體出現率比較無統計學意義，由此，我們推斷兩組卵母細胞的發育潛能無差異。但需要強調的是，我們的研究僅從紡錘體的形態學上推斷卵母細胞的發育潛能，對于卵母細胞的染色體結構上是否存在異常我們無法推斷，需要進一步大樣本的卵母細胞的染色體檢測來驗證。

綜上所述，本研究表明就解凍復蘇存活率而言，兩種處理方法效果相同。然而未成熟期玻璃化冷凍降低了卵母細胞的成熟潛能，IVM培養后再行玻璃化冷凍的方法可能更適合未成熟卵母細胞的冷凍保存。

參 考 文 獻

[1] ?VAJTA G，NAGY Z P.Are programmable freezers still needed in the embryo laboratory？Review on vitrification[J].Reprod Biomed Online，2006，12（6）：779-796.

[2] ?SON W Y，TAN S L.Comparison between slow freezing and vitrification for human embryos[J].Expert Rev Med Devices，2009，6（1）：1-7.

[3] ?CHIAN R C，LIM J H，TAN S L.State of the art in in-vitro oocyte maturation[J].Curr Opin Obstet Gynecol，2004，16（3）：211-219.

[4] ?CHIAN R C，UZELAC P S，NARGUND G.In vitro maturation of human immature oocytes for fertility preservation[J].Fertil Steril，2013，99（5）：1173-1181.

[5] ?SON W Y，HENDERSON S，COHEN Y，et al.Immature oocyte for fertility preservation[J].Front Endocrinol：Lausanne，2019，10：464.

[6] ?LEI T，GUO N，LIU J Q，et al.Vitrification of in vitro matured oocytes：effects on meiotic spindle configuration and mitochondrial function[J].Int J Clin Exp Pathol，2014，7（3）：1159-1165.

[7] ?FASANO G，DEMEESTERE I，ENGLERT Y.In-vitro maturation of human oocytes：before or after vitrification？[J].J Assist Reprod Genet，2012，29（6）：507-512.

[8] ?HUANG J Y，CHEN H Y，PARK J Y，et al.Comparison of spindle and chromosome configuration in in vitro-and in vivo-matured mouse oocytes after vitrification[J].Fertil Steril，2008，90（4 suppl）：1424-1432.

[9] ?CAO Y，XING Q，ZHANG Z G，et al.Cryopreservation of immature and in-vitro matured human oocytes by vitrification[J].Reprod Biomed Online，2009，19（3）：369-373.

[10] ?CAO Y X，CHIAN R C.Fertility preservation with immature and in vitro matured oocytes[J].Semin Reprod Med，2009，27（6）：456-464.

[11] ?KHALILI M A，SHAHEDI A，ASHOURZADEH S，et al.Vitrification of human immature oocytes before and after in vitro maturation：a review[J].J Assist Reprod Genet，2017，34（11）：1413-1426.

[12] ?MOLINA I，G ?MEZ J，BALASCH S，et al.Osmotic-shock produced by vitrification solutions improves immature human oocytes in vitro maturation[J].Reprod Biol Endocrinol，2016，14（1）：27.

[13] ?DADDANGADI A，UPPANGALA S，KALTHUR G，et al.Germinal stage vitrification is superior to MII stage vitrification in prepubertal mouse oocytes[J].Cryobiology，2020，93：49-55.

[14] ?PEINADO I，MOYA I，S ?EZ-ESPINOSA P，et al.Impact of maturation and vitrification time of human GV oocytes on the metaphase plate configuration[J].Int J Mol Sci，2021，22（3）：1125.

[15] ?BOISO I，MART ? M，SANTAL ? J，et al.A confocal microscopy analysis of the spindle and chromosome configurations of human oocytes cryopreserved at the germinal vesicle and metaphase II stage[J].Hum Reprod，2002，17（7）：1885-1891.

[16] ?RIENZI L，MARTINEZ F，UBALDI F，et al.Polscope analysis of meiotic spindle changes in living metaphase II human oocytes during the freezing and thawing procedures[J].Hum Reprod，2004，19（3）：655-659.

[17] ?CHEN S U，YANG Y S.Slow freezing or vitrification of oocytes：their effects on survival and meiotic spindles，and the time schedule for clinical practice[J].Taiwan J Obstet Gynecol，2009，48（1）：15-22.

[18] ?TAMURA A N，HUANG T T，MARIKAWA Y.Impact of vitrification on the meiotic spindle and components of the microtubule-organizing center in mouse mature oocytes[J].Biol Reprod，2013，89（5）：112.

[19] ?呂愛香.卵丘細胞在未成熟卵母細胞玻璃化冷凍中的作用及其機制研究[D].鄭州：鄭州大學，2019.

[20] ?GARC ?A-ORO S，REY M I，RODR ? GUEZ M，et al.Predictive value of spindle retardance in embryo implantation rate[J].J Assist Reprod Genet，2017，34（5）：617-625.

[21] ?MAHFOUDH A M，MOON J H，HENDERSON S，et al.Relationship between pre-ICSI meiotic spindle angle，ovarian reserve，gonadotropin stimulation，and pregnancy outcomes[J].J Assist Reprod Genet，2017，34（5）：609-615.

[22] ?SHEN Y，STALF T，MEHNERT C，et al.Light retardance by human oocyte spindle is positively related to pronuclear score after ICSI[J].Reprod Biomed Online，2006，12（6）：737-751.

[23] ?MADASCHI C，DE SOUZA BONETTI T C，DE ALMEIDA FERREIRA BRAGA D P，et al.Spindle imaging：a marker for embryo development and implantation[J].Fertil Steril，2008，90（1）：194-198.

[24] ?VERSIEREN K，HEINDRYCKX B，O'LEARY T，et al.Slow controlled-rate freezing of human in vitro matured oocytes：effects on maturation rate and kinetics and parthenogenetic activation[J].Fertil Steril，2011，96（3）：624-628.

（收稿日期：2021-04-17 修回日期：2021-06-22）

（編輯：潘明志）