基于網絡藥理學和分子對接探討熊果酸治療骨質疏松的分子機制

趙俊 孫加琳 劉洪玲 劉廣偉 李祥鵬 倉懷芹 梁瑜 張傳洲 韓冰 隋忠國

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）17-2066-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.17.04

摘 要 目的：探討熊果酸治療骨質疏松癥（OP）的潛在分子機制。方法：運用中藥系統藥理學分析平臺數據庫、PubMed數據庫、UniProt數據庫篩選單體化合物熊果酸的作用靶點基因，借助GeneCards數據庫檢索OP相關靶點基因，并運用Venny 2.1在線作圖工具獲取成分-疾病的共有靶點基因;運用STRING數據庫構建成分-疾病共有靶點基因的蛋白質-蛋白質相互作用關系（PPI）網絡并進行拓撲學分析，篩選度值大于平均度值的核心靶點基因;使用DAVID數據庫對成分-疾病共有靶點基因進行基因本體（GO）功能注釋和KEGG通路富集分析。以核心靶點基因編碼蛋白為受體、熊果酸為配體，采用AutoDock Vina 1.1.2軟件進行分子對接。結果：共挖掘出熊果酸相關靶點基因55個、OP相關靶點基因4 273個，兩者共有靶點基因44個。上述共有靶點基因的PPI網絡共包含節點44個、邊513條，平均節點度值為23.3;核心靶點基因共24個，包括VEGFA、TP53、IL6、CASP3等。共富集到GO功能條目340個（校正后P值小于0.05），其中生物過程263個（涉及凋亡過程的負調控等）、分子功能25個（涉及蛋白質結合等）、細胞組分52個（涉及胞質溶膠等）;共富集到KEGG信號通路90條（校正后P值小于0.05），如癌癥通路、乙型肝炎、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路等。熊果酸與TP53等6個核心靶點基因編碼蛋白的結合能均低于-5 kcal/mol，有較強的結合活性。結論：熊果酸對OP的治療作用可能是通過調控VEGFA、TP53、IL6、CASP3、JUN等核心靶點基因，作用于癌癥通路、乙型肝炎、TNF信號通路等多條關鍵通路而實現的。

關鍵詞 熊果酸;骨質疏松癥;網絡藥理學;分子對接;分子機制

Molecular Mechanism of Ursolic Acid in the Treatment of Osteoporosis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

ZHAO Jun，SUN Jialin，LIU Hongling，LIU Guangwei，LI Xiangpeng，CANG Huaiqin，LIANG Yu，ZHANG Chuanzhou，HAN Bing，SUI Zhongguo（Dept. of Pharmacy， the Affiliated Hospital of Qingdao University， Shandong Qingdao 266003， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To explore the potential molecular mechanism of ursolic acid in the treatment of osteoporosis （OP）. METHODS： TCMSP， PubMed database and UniProt database were used to screen potential targets of monomer compound ursolic acid. OP related target genes were searched with GeneCards database. The common target genes of component-disease were obtained by Venny 2.1 online mapping tool. The protein-protein interaction （PPI） network of component-disease common target genes was constructed by using STRING database， and topological analysis was carried out; the core target genes， whose degree value was greater than the average degree value， were screened. GO functional annotation and KEGG pathway enrichment analysis of component-disease common target genes were carried out by DAVID database. AutoDock Vina 1.1.2 software was used for molecular docking， using protein encoded by the core target gene as receptor and ursolic acid as ligand. RESULTS： A total of 55 ursolic acid related target genes and 4 273 OP related target genes were excavated， with a total of 44 common target genes. PPI network with above common target genes included 44 nodes and 513 edges， with an average node degree of 23.3. There were 24 core target genes， including VEGFA， TP53， IL6， CASP3. There were 340 GO functional items were enriched （corrected P<0.05）， including 263 biological processes （negative regulation of apoptosis， etc.）， 25 molecular functions （protein binding， etc.） and 52 cell components （cytosol， etc.）. There were 90 KEGG signaling pathways （corrected P<0.05）， such as tumor pathway， hepatitis B pathway， TNF signaling pathway， viral carcinogenesis and phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B （PI3K-Akt） signaling pathway. The binding energy between ursolic acid and 6 proteins encoded by core target genes such as TP53 was lower than -5 kcal/mol， which had strong binding activity. CONCLUSIONS： The therapeutic effect of ursolic acid on OP may be achieved by regulating VEGFA， TP53， IL6， CASP3， JUN and other core target genes and acting on multiple key pathways such as cancer pathway， hepatitis B and TNF signaling pathway.

KEYWORDS? ?Ursolic acid; Osteoporosis; Network pharmacology; Molecular docking; Molecular mechanism

隨著人口增長及老齡化的加劇，骨質疏松癥（osteoporosis，OP）的發病率也逐年上升，已成為我國主要的公共衛生問題[1]。并且，該癥還有誘發其他疾病的可能，給患者家庭和社會均造成了沉重的經濟負擔[2]。老年人是OP的主要患病人群，目前臨床上治療OP的藥物大多以調節骨代謝的化學藥為主，但其可引起腎損傷等一系列不良反應，使得其臨床應用受限[3]。OP在祖國醫學中屬于“骨痿”范疇，《素問》中載“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發為骨痿”，中醫治療以補腎益精、活血祛瘀為基本原則[4]。但中醫藥治療OP的相關分子機制并未完全闡明，這制約了相關中醫藥理論向臨床實踐的進一步轉化。

熊果酸（ursolic acid）具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種功效，在自然界分布廣泛，同時因其價格低廉、療效穩定且不良反應少而備受關注[5]。相關研究表明，熊果酸具有明顯改善腎損傷的作用[6]。而祖國醫學認為，腎虛是OP的主要病機，且中醫主張OP治療應與腎功能保護進程并行[7]。因此，根據中醫“補腎壯骨”理論，熊果酸可能具有潛在的OP改善作用。網絡藥理學是利用計算機科學、分子生物學、藥學等學科的成果，對傳統中藥成分的潛在靶點、藥理作用進行多基因、多靶點、多途徑的系統研究，可為中醫藥現代化研究提供新的思路[8]。分子對接則是通過受體與藥物分子之間的相互作用方式來預測其結合模式和親和力的一種理論模擬方法[9]。本研究擬利用網絡藥理學方法和分子對接技術，初步探討熊果酸治療OP的潛在作用靶點及通路，以期為進一步闡明熊果酸治療OP的分子機制提供依據。

1 資料與方法

1.1 熊果酸作用靶點基因的提取

通過中藥系統藥理學分析平臺數據庫（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索熊果酸的潛在作用靶點蛋白，并在PubMed數據庫（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）中進行結構比對。通過UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）將上述靶點對應的蛋白轉換成種屬為人的基因，構建熊果酸單體化合物及其作用靶點基因的數據庫。

1.2 OP相關靶點基因的篩選

以“osteoporosis”為關鍵詞，在Gene Cards數據庫（https：//www.genecards.org/）中進行人類基因檢索，以獲取OP的疾病靶點基因;同時，在該數據庫中以相關性分數（relevance score）的中位值進行篩選，以期獲得更多的疾病相關靶點基因。

1.3 成分-疾病共有靶點基因的篩選

將“1.1”“1.2”項下篩選出的兩組靶點分別輸入Venny 2.1在線作圖工具（https：// bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）以繪制韋恩圖，得到成分-疾病的共有靶點基因。

1.4 共有靶點基因的蛋白質-蛋白質相互作用關系網絡的構建及拓撲學分析

將成分-疾病的共有靶點基因導入STRING數據庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），設定生物種類為“homo sapiens（智人）”，構建共有靶點基因的蛋白質-蛋白質相互作用關系（PPI）網絡，并將構建結果導入Cytoscape 3.8.0軟件中進行可視化展示?？梢暬W絡圖中，以節點表示共有靶點基因，其顏色越深、形狀越大表示對應靶點基因的度值（degree）越大，即此靶點基因越重要;以邊表示共有靶點基因之間的關聯，其線條越粗表示靶點基因間的結合分數（combine score）越大，即靶點基因與靶點基因之間的相關性越顯著[10]。

借助Cystoscape 3.8.0軟件中的“network analyzer”工具對PPI網絡進行拓撲學分析。以度值、介數中心性（betweenness centrality）、接近中心性（closeness centrality）等3個參數的中位值為參考指標。其中，介數中心性代表經過某一節點的最短路徑的數量，介數中心性越大，該節點影響力越大[11];接近中心性代表節點與網絡中其他節點的平均距離，接近中心性越大的節點其信息流動性越佳[12];選取度值大于平均度值的靶點基因作為核心靶點基因[13]，并選取度值、介數中心性、接近中心性均排名前10位的核心靶點基因的拓撲學分析結果進行展示。

1.5 基因本體功能注釋及KEGG通路富集分析

使用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對成分-疾病的共有靶點基因進行基因本體（GO）功能注釋和KEGG通路富集分析。其中，GO功能注釋分析涉及生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞組分（CC）等功能。設置物種為“homo sapiens（智人）”、標識符（identifier）為“official gene symbol（官方名稱）”，保留校正后P值小于0.05的條目，并按照校正后P值從小到大進行排序。選擇排名前20位的條目導入RStudio 3.6.3軟件中，實現富集結果的可視化。

1.6 成分-核心靶點基因編碼蛋白的分子對接實驗

從PDB數據庫（https：//www.rcsb.org/）下載核心靶點基因編碼蛋白的三維（3D）結構，保存為“PDB”格式，作為蛋白受體。使用AutoDock Tools 1.5.6軟件對蛋白受體進行去除水分子、分離蛋白質、添加非極性氫等處理，并計算其結構的Gasteiger電荷以確保原子遵循AutoDock中的原子類型，然后將其保存為“pdbqt”格式文件。從PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載熊果酸的二維（2D）結構，保存為“mol2”格式，使用AutoDock Tools 1.5.6軟件進行加氫、加電荷、檢測配體分子的中心節點以及進行可旋轉鍵的搜尋與定義后，保存為“pdbqt”格式文件，作為配體。將受體設置為剛性，配體設置為柔性，采用AutoDock Vina 1.1.2軟件對核心靶點基因編碼蛋白受體和熊果酸配體進行分子對接。通過結合能來評估配體和受體的結合能力，結合能小于0則表示配體與受體能夠自發結合，且其值越小表示兩者的結合活性越高[14]。采用PyMOL 2.3軟件進行對接結果的可視化展示（本文僅對結合能從小到大排名前6位的化合物的對接結果進行可視化展示）。

2 結果

2.1 熊果酸與OP相關靶點基因的篩選結果

經檢索及匯總刪重后，共獲得熊果酸相關靶點基因55個;在GeneCards數據庫中共檢索到OP相關靶點基因4 273個。將上述靶點基因輸入Venny 2.1軟件中，共得到成分-疾病的共有靶點基因44個，詳見圖1。

2.2 共有靶點基因PPI網絡構建及核心靶點基因篩選結果

成分-疾病共有靶點基因的PPI可視化網絡見圖2。由圖2可見，該網絡中共有節點44個、邊513條，平均節點度值為23.3。網絡中未出現孤立節點，且各節點之間連通性良好，表明熊果酸可通過多靶點的協同調控發揮其治療OP的作用。

網絡拓撲學分析結果顯示，該網絡中節點度值大于平均度值（23.318）的核心靶點基因共有24個，度值、介數中心性、接近中心性同時排名前10位的核心靶點基因分別為VEGFA、TP53、IL6、CASP3、JUN、MMP9、STAT3、TNF、MAPK8和PTGS2，其拓撲學分析結果見表1。

2.3 GO功能富集分析結果

按校正后P值小于0.05的標準進行篩選，共富集到GO功能條目340個，BP、MF、CC分別有263、25、52個。其中，BP主要涉及凋亡過程的負調控（15個）、細胞增殖的負調控（13個）、凋亡進程（13個）、細胞增殖的正調控（13個）、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控（13個）、藥物反應（12個）等;CC主要涉及胞質溶膠（30個）、細胞核（29個）、細胞質（28個）、質膜（20個）等;MF主要涉及蛋白質結合（47個）、相同蛋白質結合（13個）、蛋白激酶結合（11個）、蛋白質異二聚化活性（11個）、蛋白質同二聚化活性（11個）等。GO功能富集分析的氣泡圖（校正后P值排名前20位）見圖3。

2.4 KEGG通路富集分析結果

按校正后P值小于0.05的標準進行篩選，共富集到KEGG信號通路90條。校正后P值排名前20位的條目的可視化展示結果見圖4，其具體信息見表2。由圖4、表2可知，熊果酸治療OP的潛在靶點包括癌癥通路、乙型肝炎、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路、人類嗜T淋巴細胞白血病病毒Ⅰ型（HTLV-Ⅰ）感染等多條通路。

2.5 成分-核心靶點基因編碼蛋白的分子對接結果

熊果酸與核心靶點基因CASP3、IL6、MAPK8、JUN、TP53、VEGFA編碼蛋白的結合能分別為-5.20、-5.43、? ?-6.68、-5.80、-6.89、-5.36 kcal/mol（1 kcal=4.186 kJ），均低于-5 kacl/mol，這提示熊果酸與核心靶點基因編碼蛋白之間有較強的結合活性[15]。以熊果酸與TP53基因編碼蛋白（p53）的結合為例，兩者的結合能為-6.89 kcal/mol，熊果酸與p53的氨基酸殘基GLY-1683可通過氫鍵連接（作用距離為2.5 ?），可得到較為穩定的復合物。熊果酸與核心靶點基因編碼蛋白的分子對接結果（結合能排名前6位）見圖5。

3 討論

OP是一種全身性骨疾病，其特征是患者骨量逐漸減少、骨質脆弱、骨折易發[16]。據首個中國OP流行病學調查結果顯示：OP已成為我國中老年人群的重要健康問題，50歲以上人群的OP患病率為19.2%;且在中老年女性中尤為嚴重，65歲以上女性的OP患病率更是達到了51.6%，嚴重影響了老年人群的生活質量[17-18]。因此，OP的相關研究受到越來越多學者的關注。

目前臨床針對OP的藥物治療仍以化學藥為主，包括雌激素、選擇性雌激素受體調節劑、雙膦酸鹽類、降鈣素和骨形成促進劑等[19]。臨床數據顯示，化學藥的大量使用除了會造成一定程度的腎損傷外，還存在誘發乳腺癌和子宮內膜癌等嚴重副作用，從而制約了其臨床應用[19]。我國傳統中醫藥在多種疾病的治療中均具有顯著的效果，且副作用小，特別適合于治療腎臟代謝功能衰退的老年性疾病[20]。因此，傳統中藥在防治腎損傷、改善OP方面具有廣闊的潛力和應用前景。

熊果酸屬于烏蘇烷型五環三萜類化合物，存在于熊果、女貞子、野薔薇果、白花蛇舌草、車前草等自然界廣泛分布的天然藥物中，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種功效，并且已有多年的應用歷史[21]。相對于目前化學藥治療OP致腎損傷等一系列不良反應，熊果酸對腎損傷具有明顯的改善作用[6]。中醫認為，腎藏精，精生髓，髓居于骨腔中以滋養骨骼，當腎精虧虛時，則骨枯髓減，故腎臟在骨骼的生長和發育中起到至關重要的作用[22]。由以上研究結果和中醫理論可見，熊果酸具有潛在的治療OP作用。

本研究共挖掘出熊果酸相關靶點基因55個，OP相關靶點基因4 273個;經韋恩圖分析，獲得成分-疾病的共有靶點基因44個。上述共有靶點基因的PPI網絡顯示，靶點基因之間相互聯系、共同作用;網絡拓撲學分析結果顯示，熊果酸治療OP的核心靶點基因主要包括VEGFA、TP53、IL6、CASP3、JUN、MMP9、STAT3、TNF、MAPK8、PTGS2等。

OP的發生發展與多種炎性細胞因子關系密切。有研究指出，白細胞介素6（IL-6）、TNF-α被證實為參與骨吸收的重要炎性細胞因子，可促進骨吸收并加重患者的病情發展[23-24]。其中，IL-6是一種多效應性炎性細胞因子，可參與炎癥反應、免疫應答、造血調節和腫瘤發生等多個過程[25]。研究表明，IL-6能通過多種信號通路調控成骨細胞的凋亡與分化，促進破骨細胞的形成，從而促進骨吸收，最終導致OP的發生[26]。此外，IL-6還能夠誘導激活Janus激酶（JAK）家族的3個成員[信號轉導及轉錄激活因子3（STAT3）、MAPK和PI3K]，而這3個因子均與OP的發生發展密切相關[27-29]。TNF-α既可以通過誘導成骨細胞表達核因子κB（NF-κB）受體活化因子配體（RANKL）表達，也可以直接作用于RANKL來誘導破骨細胞的形成和促進骨吸收[30]。劉雁飛等[31]研究發現，熊果酸可顯著降低慢性非細菌性前列腺炎模型大鼠血液中細胞因子TNF-α、IL-1β的水平。以上內容提示，IL-6、TNF-α是熊果酸治療OP的潛在靶點。

MAPK8屬于MAPK家族成員，在調節炎癥和免疫反應中具有重要作用。一方面，MAPK對于破骨細胞的形成和活化具有重要作用，并且能夠通過介導NF-κB信號通路來影響OP的發展[32];另一方面，活化的MAPK可促進成骨細胞的生成，從而發揮其改善OP癥狀的作用[33]。前列腺素可誘導巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）和RANKL表達，還可促進破骨細胞分化并抑制骨細胞功能[34]。前列腺素內過氧化物酶2（PTGS2）為前列腺素生成的限速酶，對前列腺素的上述活性有一定的抑制作用[35]。血管內皮生長因子（VEGF）兼具支持血管生成和促進成骨細胞功能的作用，可部分通過自分泌、內分泌機制以及旁分泌機制來調節成骨細胞、破骨細胞的功能，促進骨形成及減少骨吸收[36]。胱天蛋白酶（caspase）家族是調節細胞凋亡過程中的關鍵因子，其中caspase3（CASP3基因表達產物）是該家族中最關鍵的凋亡效應因子之一，被認為是凋亡的執行者，一旦caspase3被激活，細胞凋亡將不可被逆轉[37]。

本研究通過對共有靶點的GO功能注釋分析發現，GO生物過程主要集中在凋亡進程、細胞增殖調控、藥物反應等。通過對共有靶點基因的KEGG通路富集分析發現，其主要富集在腫瘤通路、TNF信號通路、乙型肝炎、PI3K/Akt信號通路、人類HTLV-Ⅰ感染等多條通路。其中，PI3K/Akt信號通路與骨組織代謝關系密切[38]。激活PI3K/Akt信號通路可刺激成骨細胞的增殖和分化，同時抑制其凋亡;另外，PI3K可刺激破骨細胞肌動蛋白絲的形成，具有調節細胞趨化、附著和擴散等功能，抑制PI3K表達可減少成熟破骨細胞的骨吸收[39]。多項研究證實，熊果酸可抑制PI3K/Akt信號通路的傳導，從而導致其下游促凋亡蛋白表達上調、內質網應激通路活化，最終促進細胞凋亡[40-41]。相關研究證實，慢性乙型肝炎病毒感染與OP之間關系密切，其作用機制可能與該病毒感染后會引起慢性炎癥有關[42]。乙型肝炎病毒感染可誘導TNF-α、IL-1、IL-6等炎性細胞因子分泌，可增加RANKL表達而刺激骨吸收[43]。上述炎性細胞因子的綜合作用是慢性乙型肝炎病毒感染致OP的主要原因，其可導致骨形成減少和骨吸收增加，從而降低骨礦物質密度[44]。另外，乙型肝炎病毒感染會抑制肝內25-羥維生素D的生成以及維生素D的攝取，從而增加骨丟失并減少骨形成[45]。長期乙型肝炎病毒感染導致的肝臟失代償會通過抑制纖維細胞生長來影響骨基質的膠原合成，同時可通過增加癌胚纖維連接蛋白的表達來共同抑制成骨細胞的功能[46]。本研究采用分子對接技術分別將熊果酸與核心靶點基因CASP3、IL6、MAPK8、JUN、TP53、VEGFA的編碼蛋白進行分子對接驗證。結果顯示，熊果酸與上述核心靶點基因編碼蛋白均有較強的對接活性（結合能均小于-5.0 kcal/mol），這進一步說明了熊果酸可與核心靶點基因編碼蛋白受體穩定結合并發揮其治療OP的作用。該結果初步驗證了上述網絡藥理學預測結果的可靠性，可為后續熊果酸治療OP的作用機制研究奠定基礎。

綜上所述，熊果酸對OP的治療作用可能是通過調控VEGFA、TP53、IL6、CASP3、JUN、MMP9、STAT3、TNF、MAPK8、PTGS2等核心靶點基因，作用于腫瘤通路、乙型肝炎、TNF信號通路等多條關鍵通路而實現的。其作用機制涉及了多個治療靶點及信號通路，體現出了中藥多靶點、多通路治療疾病的特點。但針對本研究預測的熊果酸治療OP的潛在靶點及通路，尚有待進一步通過相關實驗予以驗證。

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（收稿日期：2021-04-13 修回日期：2021-07-26）

（編輯：林 靜）