甲基蓮心堿對人下咽癌FADU細胞增殖和凋亡的影響

陳霞 謝紅衛 王永鵬 張曉萍 梁卉

【摘要】 目的：探討甲基蓮心堿對人下咽癌FADU細胞增殖、凋亡等生物學行為的影響及作用機制。方法：分別用不同濃度0μmol/L（CN組）、1μmol/L（LN組）、3μmol/L（MN組）和6μmol/L（HN組）的甲基蓮心堿體外干預FADU細胞，倒置顯微鏡觀察細胞形態改變、采用CCK-8法檢測細胞增殖的影響，采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測FADU細胞凋亡的影響。結果：CCK-8法結果顯示，與對照組比較，甲基蓮心堿用藥組可明顯抑制人下咽癌FADU細胞增殖，并呈劑量-效應關系（P<0.05）;并可誘導FADU細胞凋亡，隨藥物濃度增加，細胞凋亡愈明顯。結論：甲基蓮心堿可體外抑制人下咽癌FADU細胞的增殖、并誘導細胞凋亡。

【關鍵詞】甲基蓮心堿;人下咽癌FADU細胞;細胞增殖;細胞凋亡

【中圖分類號】R730.4 ? 【文獻標識碼】A ? 【文章編號】2026-5328（2021）09--02

甲基蓮心堿（Neferine，Nef）是從蓮心中提取出來的一種雙芐基異喹啉類生物堿，研究表明它具有抗氧化、抗炎、抗抑郁、抗纖維化、抗血小板聚集等作用。近年來研究亦發現，甲基蓮心堿在肝癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤細胞中發揮著重要的抗腫瘤作用。雖然目前甲基蓮心堿的抗腫瘤作用研究甚多，但應用于頭頸部惡性腫瘤的報道十分少見，本實驗采用不同濃度的甲基蓮心堿體外干預FADU細胞，觀察細胞增殖和凋亡等生物學行為影響，為進一步研究人下咽癌細胞機制提供實驗基礎。

1.材料

人下咽癌FADU細胞購自中科院生物化學與細胞生物學研究所;甲基蓮心堿購自上海源葉生物公司;胎牛血清購自上海四季青公司;DMEM培養液購自美國Hyclone;細胞增殖檢測試劑盒（CCK-8）購上海碧云天生物技術有限公司;細胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V法）購自上海前塵生物科技有限公司。

2.方法

2.1細胞培養：FADU細胞用10%胎牛血清和1x105U/L青鏈霉素的DMEM培養液于5%CO2、37℃飽和濕度的培養箱中培養，每2天傳代1次，取對數生長期細胞進行觀察及下一步研究。

2.2形態學觀察：取對數生長期FADU細胞胰酶消化傳代后，分成四組，計數以2x105個/mL的密度接種到6孔培養板中，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度0μmol/L（CN組）、1μmol/L（LN組）、3μmol/L（MN組）和6μmol/L（HN組）的甲基蓮心堿液進行干預共同培養，24小時后，采用倒置顯微鏡觀察細胞形態的改變。

2.3CCK-8法檢測細胞增殖/毒性影響：取對數生長期的腫瘤細胞胰酶消化后，將細胞懸液濃度調至2×104/mL，每孔100μL接種到96孔板中，預培養24小時（37℃，5%CO2），待細胞貼壁后加入10μL四種不同濃度0μmol/L（CN組）、1μmol/L（LN組）、3μmol/L（MN組）和6μmol/L（HN組）的甲基蓮心堿溶液進行干預，分別進行0h，24h，48h，72h的分段培養，并在對應時間段加入10μL CCK-8反應液（不生成氣泡），孵育1-2h，用酶標儀在450nm處測定吸光度（OD）并記錄數值，按公式計算各組增殖抑制率：細胞增殖抑制率（%）=（1-用藥組OD/對照組OD）×100%。

2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測FADU細胞凋亡的影響：取對數生長期FADU細胞胰酶消化后，密度調至2×105/mL，接種到6孔培養板中，待細胞貼壁后，加入現配的0μmol/L（CN組）、1μmol/L（LN組）、3μmol/L（MN組）和6μmol/L（HN組）甲基蓮心堿液干預，48小時后，PBS液洗滌細胞2次，加入5μl V-FITC與5μl Propidium Iodide混勻，室溫避光反應10分鐘，分別加入400μL 1× Binding Buffer，混勻后置于冰上，1小時內用流式細胞儀定量檢測細胞凋亡情況并記錄。

2.5統計學處理：采用SPSS20.0軟件作統計學處理，實驗數據采用用平均數±標準差（±s）表示，組間差異比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

3.結果

3.1甲基蓮心堿干預FADU細胞后的形態學觀察：與CN組比較，用藥組細胞數量減少，細胞形態皺縮或變形，細胞核皺縮較為明顯，細胞膜內陷，并出現觸角樣改變，隨著藥物劑量濃度加大，細胞皺縮愈明顯。

3.2CCK-8法檢測甲基蓮心堿對FADU細胞的增殖影響：結果顯示，與CN組比較用藥組細胞增殖明顯受抑制，抑制率差異明顯（P<0.05）;不同濃度給藥組（LN組、MN組和HN組）組間相互比較，細胞增殖抑制率差異也十分顯著（P<0.05），且抑制程度呈現劑量和時間依賴性（見表1）。

4.討論

人下咽癌（hypopharyngeal carcinoma）屬頭頸部的惡性腫瘤，占頭頸部惡性腫瘤發病率的5-10%[1]，95%以上是鱗狀細胞癌，75%以上的患者在醫院診斷為下咽癌時均已處于中晚期，大都發生了局部浸潤及淋巴結等遠處轉移，因此下咽癌的預后極差[2]。手術+術后放化療是目前臨床治療下咽癌的最佳方法，但手術切除病灶作為目前下咽癌的首選治療方案[3]，術后復發率極高，五年生存率僅不到35%[4]。術后綜合放射治療和化學治療的方案，可提高生存率，但下咽癌細胞的易侵襲性、易轉移性嚴重影響了下咽癌的治愈率，使其術后復發率及死亡率高居不下。目前下咽癌主要使用順鉑等鉑類抗癌藥物[5]進行術后的化學治療，此抗腫瘤藥物毒副作用較大，且費用昂貴，因此尋找一種更加有效、安全且經濟的方法對于下咽癌患者具有十分重要的臨床價值和意義。

甲基蓮心堿是一種從植物蓮中提取出來的天然藥物，研究表明，Nef具有抗炎、抗氧化等作用，另有研究表明甲基蓮心堿可通過誘導腫瘤細胞凋亡，阻滯細胞周期和影響腫瘤細胞自噬而發揮抗腫瘤作用，同時可提高化療的敏感性、降低腫瘤治療毒性等重要作用。如Nef可通過影響細胞內活性氧（ROS），谷胱甘肽（GSH）等誘導肝癌細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞的增殖[6，7];可通過調節cyclinD等阻滯骨肉瘤細胞周期進程[8]。甲基蓮心堿可調節P-gP和 MRP逆轉胃癌細胞對長春新堿的耐藥性[9];可調節MAPK通路等加強阿霉素對肺癌細胞治療作用[10];可調節粘著蛋白、波形蛋白等增加奧沙利鉑對肝癌細胞的敏感性[11];還可調節線粒體轉位等增強化療藥物對乳腺癌的治療作用[12]。甲基蓮心堿在增強抗腫瘤作用的同時，可通過催化自由基的形成降低阿霉素對心臟的毒性[13]，可通過激活MAPK/mTOR信號通路降低順鉑對腎臟的毒性[14，15]。本研究結果表明，甲基蓮心堿用藥組可明顯抑制FADU細胞增殖，隨著濃度增加，抑制率也增高;而用藥組的細胞凋亡數量較對照組數量高，濃度愈高細胞凋亡愈明顯。

總之，甲基蓮心堿可抑制人下咽癌FADU細胞的增殖，并誘導細胞發生凋亡，但具體是通過什么信號途徑或方式使細胞凋亡，仍需要進一步的研究。

參考文獻：

[1] ?Takes R， Strojan P，Silver C，et al. Current trends in initial management of hypopharyngea cancer： the declining use of open surgery[J]. Head and Neck. 2012，34：270-281.

[2] Joo Y H，Cho K J，Lee Y S， et al. Prognostic impact of perineural invasion in hypopharyngeal squamous cell carcinoma[J]. Acta Otolaryngol， 2016，136：1069-1073.

[3] 劉良發，董研博.下咽癌的外科治療進展[J].中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2017，23（3）：189-195.

[4] 張宗敏，唐平章，徐震綱等.下咽癌不同治療方案的臨床分析[J]，中華腫瘤雜志，2005，27（1）：48-51.

[5] 路鐵，李振東，李樹春等，321例下咽癌患者臨床特征及兩種治療方式療效分析[J]，臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2019，33（3）：275-279.

[6]Poornima P，Quency R，Padama V.Neferine induces reactive oxygen species mediated intrinsic pathway of apoptosis in HepG2 cells[J].Food Chem，2013，136（2）：659-667.

[7] 周雅君，時菁，田耕等，甲基蓮心堿體外抑制人肝癌細胞增殖和侵襲的作用機制研究[J].中國藥理學通報，2016，32（11）：1539-1542.

[8]Yoon J，Kim H，Yadunandam A， et al. Neferine isolate from Nelumbo nucifera enhances anti-cancer activities in Hep3B cells：molecular meechanisms of cell cycle arrest， ER stress induced apoptosis and anti-angiogenic response[J]. Phytomedicine，2013，209（11）：1013-1022.

[9]甲基蓮心堿對長春新堿抑制人胃癌細胞增殖作用的影響[J]，臨床腫瘤學雜志，2008，5（13）：427-431.

[10]甲基蓮心堿增強順氯氨鉑對Lewis肺癌的化療作用[J]，腫瘤學雜志，2004，10（1）：17-19.

[11]甲基蓮心堿體外抑制人肝癌細胞增殖和侵襲的作用機制研究[J]，中國藥理學通報，2016，32（11）：1539-1542.

[12]甲基蓮心堿逆轉肝癌HepG2/thermotolerance細胞對阿霉素耐受性的作用[J]，癌癥，2007，26（4）：357-360.

[13]張永飛，崔久嵬?；熕幬锼滦呐K毒性的研究進展[J].中國腫瘤臨床，2018，45（24）：1243-1247.

[14]楊慧海，王露露，范超等，中藥有效成分減輕順鉑腎毒性研究進展[J]。上海中醫藥雜志，2017，51（5）：98-101.

[15]Li H，Tang Y，Wen l，et al. Neferine reduces cisplaytin-induced nephrotoxicity by enhancing antophagy via the MAPK/Mtor signaling pathway[J].Biochem Biophys Res Commun，2017，484（3）：694-701.

作者簡介：陳霞，1980.10 ，女，漢 ，江西省 萍鄉市，碩士 ，講師 ， 研究方向或從事工作：耳鼻咽喉腫瘤發病機制研究