大氣顆粒物暴露兒童血清多環芳烴加合物與白細胞miR-638的劑量-效應關系

林楊，尹京晶，孟慶玉，王振杰，吳難，張麗雅，王婷，王艷華，段化偉

中國疾病預防控制中心職業衛生與中毒控制所，北京 100050

最近的世界衛生組織研究報告指出，空氣污染每年可導致全球約380 萬人過早死亡［1］。在全球大多數地區，大氣顆粒物（particulate Matter，PM）仍然是主要的空氣污染物［2］。兒童的呼吸系統發育還不夠完善，是大氣顆粒物的敏感人群［3］。流行病學研究表明，顆粒物及其富集的多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH）組分可致兒童哮喘、肺部感染和過敏風險增加［4］。PM 組分復雜，其中附著在表面的PAH是毒性較為明確且含量高的組分，大部分人群流行病學研究通過監測其在體內的代謝物，如羥基PAH代謝物和多環芳烴加合物，用于評估PM暴露水平［5-7］。苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，BaP）是致癌性最強的一種多環芳烴，經機體代謝產生活性產物二羥環氧苯并芘（benzo[a]pyrene diol epoxide，BPDE），結合血液中的白蛋白后，形成穩定且容易被檢測的BPDE-白蛋白加合物，可作為多環芳烴長期暴露生物標志物［8］。

表觀遺傳學在環境暴露和健康相關事件之間扮演著重要角色。微小RNA（microRNA，miRNA）屬于表觀遺傳學中的非編碼RNA分子，約有21～22個核苷酸，是基因表達的關鍵調節分子，靶向結合mRNA的3’端非翻譯區，改變基因表達［9］。miRNA調控相關靶基因介導PM暴露引起不良健康損害如炎癥反應、氧化應激損傷和心血管系統疾病發生，具有成為PM暴露生物標志物潛力［10］。miR-638位于染色體19p13.2上，參與調控氧化應激、DNA損傷和衰老等損傷相關靶基因的表達，在心血管疾病、呼吸系統疾病和免疫系統疾病中起重要作用［11-13］。有研究表明PAH可異常調控兒童外周血白細胞miRNA表達，減弱機體炎癥反應［5］，目前關于PM及PAH組分與兒童miR-638表達改變的流行病學研究較少。本研究通過測定大氣顆粒物暴露兒童血清中BPDE-白蛋白加合物與外周血白細胞miR-638表達水平，探討多環芳烴與白細胞miR-638的劑量-效應關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象及顆粒物暴露情況

1.1.1 研究對象于2016年秋季，在華東地區某市兩所寄宿制學校招募符合標準的學齡兒童，詳細信息可以參考課題組已發表的文獻［5，14］。兒童納入研究標準：（1）本地常住人口，居住年限≥6 個月；（2）選取住宿制學生，每周住校至少5 d；（3）無免疫功能缺陷和感染性疾??；（4）調查期間一個月內無抗生素藥物接觸史。低暴露組學校在高暴露組學校上風向至少30 km 以外區域，高暴露組學校附近有耐火材料公司、鋼鐵公司、石油公司等。本次研究最終納入273 名學齡兒童，其中高暴露組163 人，低暴露組110 人。由于有3 人的白細胞RNA 質量和完整性不符合質控要求，最終納入分析的高暴露組162 人，低暴露組有108人。本研究通過了中國疾病預防控制中心職業衛生與中毒控制所倫理委員會審查（倫理編號：NIOHP 201809），體檢開始前告知學生家長并簽署知情同意書。

1.1.2 環境暴露評估收集2016年兩學校附近監測站點的全年顆粒物暴露數據，包括PM2.5、PM10數據。在學校內進行固定點采樣，使用空氣總懸浮微粒采樣器（TH150D Ⅱ，中國武漢）收集顆粒物。稱重法測定PM2.5濃度，氣相色譜-質譜儀（450-320，美國Bruker公司）測定BaP濃度。

1.2 問卷調查

對調查員進行培訓和統一標準后，由學生家長填報調查信息，調查兒童年齡、性別、被動吸煙等情況，身高和體重由專業人員按照統一標準進行測量。

1.3 生物樣本采集

體檢當天上午采集血液和尿液樣本，采樣前學生至少空腹8 h，由經過統一培訓的護士采集前臂靜脈乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝血和不抗凝血約5 mL，中段尿30～50 mL，向用于提取RNA 的血液中加入適量的RNAlater（AM7021，美國賽默飛公司），分裝后放于-80℃冰箱儲存。

1.4 實驗室檢測

1.4.1 白細胞計數使用血細胞分析儀（Sysmex XE 5000，日本Sysmex株式會社）對白細胞進行計數。

1.4.2 尿可替寧測定煙草是BaP 的來源之一，測定尿可替寧水平是為了評估煙草暴露水平。使用氣相色譜-質譜儀（450-320，美國Bruker 公司）檢測尿中可替寧濃度，檢出限為20 ng·mL-1，樣品濃度低于檢出限的用1/2檢出限代替。

1.4.3 血清BPDE-白蛋白加合物檢測使用BPDE-白蛋白試劑盒（美國Trevigen 公司），ELISA 法檢測血清中BPDE-白蛋白加合物濃度。按照說明書操作，使用多功能酶標儀（VICTORTMX3，美國Perkin Elmer 公司）在450 nm波長檢測微孔板并進行讀數。每塊板中保證均有質控樣本、低暴露組和高暴露組樣本，每個樣本設置2個復孔。血清BPDE-白蛋白加合物檢出限為5 nmol·L-1，批內差異在0.47%～3.55%之間，批間差異為14.61%。

1.4.4 白細胞RNA提取將血液樣本從-80℃取出后置于4℃融化，吸取含有200 μL血液的樣本放入管中，加入750 μL PBS 緩沖液，7 253×g離心3 min 后，棄上清，加入1 mL Trizol（美國賽默飛公司）吹打混勻，再加入2.5×10-4nmol miRNA 檢測外參應用液（CR100，北京天根生化科技有限公司）；加入氯仿后離心，經異丙醇和75%乙醇處理后，加入無RNA 去離子水溶解RNA。分光光度計（NanoDrop 2000c，美國賽默飛公司）測定RNA濃度，使用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。

1.4.5 實時熒光定量PCR 檢測miR-638 表達使用miRcute plus miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（KR211，北京天根生化科技有限公司）將提取的RNA 逆轉錄合成cDNA。使用miRcute 增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）（FP411，北京天根生化科技有限公司）定量檢測。外參引物（CD200-01）和miR-638（引物序列：AGGGAUCGCGGGCGGGUGGCGGCCU）購于北京天根生化科技有限公司。使用熒光定量 PCR 儀（Quant Studio 12K，美國賽默飛公司）檢測miR-638 表達，PCR反應程序：95℃、15 min；94℃、20 s；60℃、34 s，擴增40個循環。樣本定量設置重復孔，復孔間Ct值標準差＜0.5；去離子水做空白對照，無非特異性擴增；板間設置同一質量控制樣本，板間質控CV＜15%；否則重做。采用2-ΔΔCt法計算miRNA 的相對表達量。

1.5 統計學分析

數據分析采用R 4.0.3 統計軟件。正態性數據采用±s表示，年齡、血清BPDE-白蛋白加合物兩組間比較采用t檢驗。非正態性資料采用M（P25，P75）表示，兩組間PM2.5、PM10、白細胞計數、miR-638表達比較采用Wilcox 秩和檢驗。根據世界衛生組織頒布的兒童生長標準將體重指數（body mass index，BMI）z-評分＞1 劃為超重，反之為正常體重［15］。按照尿可替寧是否高出檢出限（＞20 ng·mL-1）分為尿可替寧檢出組和非檢出組，反映煙草暴露情況。計數資料如性別、BMIz-評分、尿可替寧檢出率的比較采用χ2檢驗。白細胞miR-638、血清BPDE-白蛋白加合物、白細胞計數經自然對數（ln）轉換后納入線性回歸模型分析。以組別為自變量，miR-638 表達水平為應變量，調整年齡、性別、BMIz-評分，血清BPDE-白蛋白加合物、尿可替寧和白細胞計數協變量后，分析兩組兒童白細胞miR-638 表達差異；以血清BPDE-白蛋白加合物為自變量，白細胞miR-638 為應變量，采用線性回歸分析血清BPDE-白蛋白加合物與miR-638 表達劑量-效應關系。在體重、尿可替寧水平和性別分層分析中，線性回歸分析選擇不同的協變量進行校正。所有檢驗均為雙側檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 兩組兒童顆粒物暴露水平和基本特征

高暴露組區域PM2.5、PM10年平均暴露水平（環境監測站）均高于低暴露組，分別是低暴露組的1.7和2.1倍（P＜0.001）。大氣顆粒物高暴露組區域（學校定點采樣）PM2.5（98.79 μg·m-3）均比低暴露組（54.20 μg·m-3）高（P=0.025），且PM2.5與BaP濃度（r=0.691，P＜0.001）呈正相關。未發現兩組兒童間年齡、性別、尿可替寧檢出比例、白細胞計數有差異（P＞0.05）；高暴露組兒童血清BPDE-白蛋白加合物水平［（82.41±20.12）nmol·L-1］高于低暴露組［（64.84±14.26）nmol·L-1］（P＜0.001）；高暴露組兒童BMIz-評分超重比例（34.57%）高于低暴露組（23.15%）（P=0.045）。見表1。

表1 顆粒物暴露組兒童人群基本情況Table 1 General characteristics of children exposed to particulate matter

2.2 顆粒物暴露與兒童白細胞miR-638表達改變

線性回歸模型分析結果顯示，校正年齡、性別、BMIz-評分、尿可替寧和白細胞計數水平后，大氣顆粒物高暴露組兒童白細胞miR-638 表達升高，是低暴露組的1.4 倍（P＜0.001）。亞組分析發現，校正協變量后，在男生中，高暴露組白細胞miR-638 表達水平高于低暴露組（P=0.002）；在正常體重兒童中，高暴露組miR-638 表達水平高于低暴露組（P=0.011）；在尿可替寧未檢出兒童中，高暴露組miR-638 表達水平高于低暴露組（P=0.006）。見表2。

表2 兩組兒童外周血白細胞miR-638 水平比較Table 2 Comparison of miR-638 expression in peripheral blood leukocytes between low- and high-PM exposed groups

2.3 血清BPDE-白蛋白加合物與白細胞miR-638 相關性分析

如圖1所示，全人群、高暴露組兒童中血清BPDE-白蛋白加合物與白細胞miR-638 表達水平呈正相關（r值分別為0.25、0.22，P＜0.05）。

圖1 全人群（A）、高暴露組（B）和低暴露組（C）血清BPDE-白蛋白加合物與白細胞miR-638 相關分析Figure 1 Correlation between serum BPDE-albumin adducts and leukocyte miR-638 expression among total population (A),high-PM exposure group (B),and low-PM exposure group (C)

2.4 血清BPDE-白蛋白加合物與白細胞miR-638 劑量-效應關系分析

線性回歸模型分析結果顯示，校正年齡、性別、尿可替寧、BMIz-評分和白細胞數目等變量后，兒童血清BPDE-白蛋白加合物每增加一個IQR（27.09 nmol·L-1），外周血白細胞miR-638表達增加24.56%（P＜0.001）；高暴露組兒童血清BPDE-白蛋白加合物每增加一個IQR（25.95 nmol·L-1），其白細胞miR-638 表達增加19.28%（P=0.003）。亞組分析中，男生和女生血清BPDE-白蛋白加合物每增加一個IQR（27.34 nmol·L-1和28.84 nmol·L-1），白細胞miR-638表達增加20.60%和34.57%（P＜0.05）；正常體重兒童組，血清BPDE-白蛋白加合物每增加一個IQR（24.74 nmol·L-1），miR-638 表達增加26.89%（P＜0.001）；在尿可替寧未檢出組中，兒童血清BPDE-白蛋白加合物每增加一個IQR（25.06 nmol·L-1），miR-638表達增加23.78%（P＜0.001）。詳見表3。

表3 不同人群中BPDE-白蛋白加合物與miR-638 劑量-效應關系分析Table 3 Dose-effect relationship between BPDE-albumin adducts and miR-638 in different groups of children

3 討論

大氣顆粒物可以引發兒童體內的氧化應激和炎癥反應改變，進而導致呼吸系統和心血管系統疾?。?6-17］。大氣顆粒物中較為關注的有機類有害組分是PAH，其中BaP 經機體代謝產生BPDE-白蛋白加合物，在血液中半衰期較長，可反映多環芳烴的長期暴露［18-19］。結合暴露評估和表觀遺傳學生物標志物分析，本研究發現高水平顆粒物暴露組兒童中，血清BPDE-白蛋白加合物與白細胞miR-638正相關，并表現出較好的劑量-效應關系。這提示在兒童等敏感人群中，顆粒物中PAH 組分可以通過調控miRNA 等分子改變，誘導機體的有害效應。

暴露于環境污染物時，外周血白細胞miR-638 表達失調，可調控相關靶基因參與DNA 損傷、氧化應激反應［11，20-23］。本研究結果顯示，大氣顆粒物高暴露組兒童外周血白細胞miR-638高于低暴露組，并與PAH組分具有暴露-反應關系。Li等［22］研究發現miR-638在16HBE細胞中表達與BaP呈劑量-效應依賴式增加，人群研究驗證發現與對照組相比，暴露于PAH 的焦爐工人外周血白細胞miR-638 表達增加了72%，這與本研究結果相一致。體外研究發現，亞砷酸鹽染毒后，人Jurkat 細胞miR-638 表達水平也升高［23］。Christenson等［13］發現miR-638 隨著肺氣腫的嚴重程度增加而表達上調，提示 miR-638 靶向調控細胞外基質修復相關基因，導致修復能力下降，引起氧化損傷并進一步加重肺氣腫的進程。

暴露于PM2.5中的PAH 組分時，無論是成人還是兒童，男性的吸入率和暴露時間均高于女性［24］。本研究發現男生和女生體內的血清BPDE-白蛋白加合物水平與miR-638 水平存在劑量-效應關系，但是兩組間比較時發現高暴露組男生白細胞miR-638 水平高于低顆粒物暴露組，這可能是男生較女生暴露較多的顆粒物及有害組分。

環境煙草暴露是大氣顆粒物研究中的主要混雜因素，也會影響兒童的健康［25］。本研究采用尿可替寧水平評估兒童煙草暴露情況，研究發現在尿可替寧未檢出組，高顆粒物暴露組兒童白細胞miR-638 水平升高。而尿可替寧檢出組卻沒有發現該差異。提示不存在煙草暴露時，兒童外周血白細胞miR-638 表達水平升高，可能是顆粒物PAH組分致兒童血清BPDE-白蛋白加合物升高所致；煙草中其他成分暴露可能干擾了白細胞miR-638表達，顆粒物是否與香煙產生協同作用影響miR-638表達的機制尚不清楚，值得進一步研究。本研究中，正常體重兒童中高暴露組miR-638表達水平高于低暴露組，且存在劑量-效應關系，而超重兒童兩組間沒有差異。Iacomino 等［26］也發現兒童超重/肥胖是血液中miRNA 改變的危險因素，可引起外周血中大部分miRNA表達降低。

本研究的主要優勢為：（1）研究人群為寄宿制學校的兒童，選擇學校附近監測站數據能夠反映兒童長期暴露水平，兩個學校食堂不提供燒烤類食品，孩子的家庭中均使用清潔燃料，減少了大部分飲食和室內污染多環芳烴來源的影響；（2）檢測了尿可替寧水平評估煙草暴露，作為協變量納入統計模型，排除了煙草混雜因素的影響，從而增加血清BPDE-白蛋白加合物評估顆粒物暴露水平的可靠性；（3）據了解這是第一個研究兒童顆粒物暴露與白細胞miR-638表達水平關系，分析血清BPDE-白蛋白加合物與白細胞miR-638的劑量-效應關系。本研究也存在一定的局限性：（1）作為一項橫斷面調查研究，不足以進行因果關系的推斷，還需要進一步深入研究；（2）由于學齡兒童上課、體育運動等特殊性，較難開展個體暴露監測，只能通過定點采樣結果評估兩組兒童PM暴露水平。

綜上所述，大氣顆粒物暴露可致兒童外周血白細胞miR-638水平升高，顆粒物中的多環芳烴組分可能是引起白細胞miR-638表達改變的主要有害因素。兒童血清中的多環芳烴-白蛋白加合物與miR-638存在劑量-效應關系。研究提示，在兒童等敏感人群的環境健康保護工作中，不僅要監測和控制顆粒物水平，更要關注其中多環芳烴等有害組分的控制和標志物研究。