氨曲南及其注射劑無菌檢查方法適用性試驗

傅莉萍，王朝麗，李 婷，張 平*

(1.上海市松江食品藥品檢驗所微生物檢驗室,上海 201600；2.?？谑兄扑帍S有限公司,?？?570311；3.上海美迪西生物醫藥有限公司，上海 200120)

氨曲南是單酰胺環類的新型β-內酰胺類抗菌藥，通過抑制細菌細胞壁的合成發揮殺菌作用，對G-桿菌細胞膜上的青霉素結合蛋白(penicillin-binding protein，PBP)-3有高度親和力，從而導致細胞溶解、死亡。氨曲南的抗菌譜主要為G-菌，臨床主要用于敏感需氧G-菌所致感染[1]。制劑的無菌性是臨床安全用藥的重要保障，無菌檢查法是保障無菌制劑安全性的重要方法[2]。方法適用性試驗是考察所采用的方法是否適用于該產品的無菌檢查，以避免對檢查結果的誤判[3]?？股仡惼贩N無菌檢查結果準確與否的關鍵是無菌檢查過程中對其抑菌性的有效消除[4]。本研究采用增加薄膜過濾法沖洗量，并在培養基中添加青霉素酶的方法，通過3個批次獨立的方法適用性試驗，為氨曲南及其注射劑建立了一種準確、高效的無菌檢查方法。

1 材 料

1.1 儀器和菌種 C級背景局部A級的凈化工作臺、MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌鍋(日本Panasonic公司)；PL402-L電子天平(梅特勒-托力多公司)；KS12生物安全柜(Thermo公司)；BD400微生物培養箱(德國Binder公司)；HTY-602A集菌儀、KDGB330/NKF330集菌培養器(浙江泰林生物技術股份有限公司)。金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、大腸桿菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]標準質控菌株均購自浙江泰林生物技術股份有限公司，菌種使用前均經鑒定，確認合格。

1.2 試劑和藥品 pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、硫乙醇酸鹽流體培養基、胰酪大豆胨液體培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基、哥倫比亞瓊脂培養基(北京三藥科技開發公司)；精氨酸(分析純，上海麥克林生化科技有限公司)；氯化鈉(分析純，上海凌峰化學試劑公司)。以上試劑使用前均經無菌性檢查和靈敏度檢查，確認合格。青霉素酶[規格：>300萬單位/ml×5 ml，阿拉丁試劑(上海)有限公司]。氨曲南原料藥(批號SS06042001001、SS06042001002、SS06042001003，重慶天地藥業有限責任公司);注射用氨曲南(規格：0.5 g，批號09200222、09200223、09200224，?？谑兄扑帍S有限公司)。

2 方法和結果

2.1 薄膜過濾法 取每種培養基規定接種的供試品總量，用薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入<100 CFU試驗菌，加硫乙醇酸鹽流體培養基或胰酪大豆胨液體培養基至濾筒內。另取一個裝有等體積培養基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。置規定溫度培養，培養時間不得超過5 d。其余試驗菌采用同法操作。

2.2 菌液的制備 根據菌種說明書，分別取1支金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉(濃度均為110～1100 CFU/pcs)的標準菌株，用2.2 ml生理鹽水渦旋振蕩溶解，作為工作用菌懸液。使用時取0.1 ml加入過濾器，使最終制備的供試品液中含菌落數≤100 CFU。

2.3 供試品溶液的制備 (1)氨曲南原料藥：按《中華人民共和國藥典》(以下簡稱中國藥典)四部通則1101，出廠檢驗抗生素固體原料藥≥5 g，取6個容器，每個容器供試品接入每種培養基的最少量0.5 g，即做方法適用性試驗時每種培養基接入的供試品總量為6×0.5 g=3 g。在A級環境下稱取9 g氨曲南原料藥作為三聯罐集菌器的用量，加2.34%精氨酸無菌溶液200 ml使溶解，可以每次3 g，分次稱取，分次加入2.34%精氨酸無菌溶液，使總溶劑體積為200 ml。(2)注射用氨曲南：按中國藥典四部通則1101，注射劑出廠檢驗批產量>500支，接種每種培養基的最少檢驗數量為20支。300 mg≤固體制劑≤5 g，每支供試品接入每種培養基的最少量是150 mg，即方法適用性試驗時每種培養基接入的樣品總量為20支×0.15 g/支=3 g，即注射用氨曲南的用量。取18支注射用氨曲南作為三聯罐集菌器的用量，每支分別加0.9%氯化鈉無菌溶液溶解，并稀釋成氨曲南濃度為90 mg/ml的溶液。

2.4 方法適用性試驗 以氨曲南原料藥(批號SS06042001001)作為試驗組研究對象， 按表1設計無菌檢查方法適用性試驗。

2.4.1 試驗組(氨曲南原料藥) 取1套三聯罐集菌器，用少量的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液潤濕濾膜，取200 ml供試品溶液平均濾入三聯罐集菌器中(相當于每罐含氨曲南3 g)，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為 100 ml。根據試驗方案設計的沖洗量沖洗濾膜，在最后一次沖洗液中分別加入<100 CFU的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、生孢梭菌的菌懸液。每個集菌器中注入100 ml硫乙醇酸鹽流體培養基，每個集菌器中加入試驗方案設計的中和劑溶液。同法制備胰酪大豆胨液體培養基集菌器罐，分別加入<100 CFU的枯草芽孢桿菌、白念珠菌和黑曲霉的菌懸液。

2.4.2 試驗組(注射用氨曲南) 取18支注射用氨曲南，每支分別加0.9%氯化鈉無菌溶液溶解并稀釋成含氨曲南90 mg/ml的供試品溶液。取1套三聯罐集菌器，用少量的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液潤濕濾膜，將18支供試品溶液平均濾入三聯罐集菌器中(相當于每罐含氨曲南3 g)，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為 100 ml。根據試驗方案設計的沖洗量沖洗濾膜，在最后一次沖洗液中分別加入<100 CFU的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、生孢梭菌的菌懸液。每個集菌器中注入100 ml硫乙醇酸鹽流體培養基，每個集菌器中加入試驗方案設計的中和劑溶液。同法制備胰酪大豆胨液體培養基集菌器罐，分別加入<100 CFU的枯草芽孢桿菌、白念珠菌和黑曲霉的菌懸液。

2.4.3 菌液對照組 以0.9%氯化鈉無菌溶液替代供試品溶液，按照試驗組(注射用氨曲南)操作，不加中和劑，6個集菌器分別加入6種試驗菌。

2.4.4 中和劑對照組 以0.9%氯化鈉無菌溶液替代供試品溶液，按照試驗組(氨曲南原料藥)操作，加入中和劑溶液，6個集菌器分別加入6種試驗菌。

2.4.5 供試品對照組 取制備好的供試品溶液(三聯罐集菌器每罐含氨曲南3 g)，以0.9%氯化鈉無菌溶液代替試驗菌液，其余操作與試驗組(氨曲南原料藥)相同，加入中和劑溶液。

2.4.6 陰性對照組 以0.9%氯化鈉無菌溶液替代供試品溶液，按照試驗組(氨曲南原料藥)操作，不加中和劑，不加試驗菌液。將上述硫乙醇酸鹽流體培養基集菌器置30～35 ℃培養箱中培養，胰酪大豆胨液體培養基集菌器置20～25 ℃的培養箱培養，培養時長不得超過5 d。

2.5 方法適用性試驗

2.5.1 菌落計數結果 取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、生孢梭菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌和黑曲霉工作用菌懸液0.1 ml置平皿中，分別加入適量瓊脂培養基，在適宜的溫度培養后，菌落計數均<100 CFU。菌落計數結果見表2。

表2 菌落計數結果Table 2 Colony count results

2.5.2 試驗方法確認 以氨曲南原料藥(批號SS06042001001)作為試驗組研究對象，5種方案試驗結果見表3。以青霉素酶作為中和劑，只有方案5中的6種試驗菌在5 d之內均生長良好。最終確認以方案5作為氨曲南無菌檢查方法，即以600萬單位青霉素酶作為中和劑，用800 ml沖洗液沖洗。

表3 5種試驗方案的測定結果Table 3 Results of the five test schemes

2.5.3 方法適用性試驗結果 取3批氨曲南原料藥(批號SS06042001001、SS06042001002、SS06042001003)，分別進行3次方法適用性試驗，結果見表4。3批供試品試驗組、中和劑對照組與陽性對照組比較，6種試驗菌均生長良好，并且與菌液對照組的培養結果相似，說明供試品在該檢驗條件下抑菌作用完全消除，并且以青霉素酶作為中和劑對6種試驗菌的生長無影響，可按該法進行氨曲南原料藥的無菌檢查。

表4 氨曲南原料藥無菌檢查方法適用性試驗結果Table 4 Results of applicability of the sterility test for aztreonam material

取3批注射用氨曲南(批號09200222、09200223、09200224)，分別進行3次方法適用性試驗，結果見表5。3批供試品試驗組、中和劑對照組與陽性對照組比較，6種試驗菌均生長良好，并且與菌液對照組的培養結果相似，說明供試品在該檢驗條件下抑菌作用完全消除，并且以青霉素酶作為中和劑對6種試驗菌的生長無影響，可按該法進行注射用氨曲南的無菌檢查。

表5 注射用氨曲南方法適用性試驗結果Table 5 Results of applicability of sterility test for aztreonam for injection

2.6 建立無菌檢查方法 取氨曲南原料藥9 g， 加200 ml的2.34%精氨酸無菌溶液使溶解，經薄膜過濾法處理，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分次沖洗(每膜沖洗量800 ml)，每管培養基中加入≥600萬單位的青霉素酶，以大腸桿菌為陽性對照菌，依法檢查，應符合規定。取適量注射用氨曲南，加0.9%氯化鈉無菌溶液溶解并稀釋成含氨曲南90 mg/ml的溶液，按照氨曲南項下的方法檢查，結果符合規定。

3 討 論

中國藥典氨曲南項下規定[5]，氨曲南為微溶于水的白色至淡黃色結晶性粉末，無菌檢查時取9 g溶于100 ml的2.34%精氨酸溶液中。為了保證本品的溶解度和溶解速度，在氨曲南中加入一定比例精氨酸，可以起到促進氨曲南溶解和穩定的作用。本研究實際操作過程中發現，100 ml的2.34%精氨酸溶液很難溶解9 g氨曲南，且放置后氨曲南易發生氧化反應，產生雜質，使溶液變紅，無法采用薄膜過濾法進行無菌檢查。中國藥典2020年版四部通則1101無菌檢查法規定[6]，無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法，只要供試品性質允許，應采用薄膜過濾法。薄膜過濾法在藥品無菌檢查中應用越來越廣泛，是無菌檢查的首選方法[7]。本研究摸索了溶解氨曲南溶劑的量，最終確定采用分步稱量，將200 ml的2.34%精氨酸溶液逐步加入，既能快速、完全溶解9 g氨曲南，防止氨曲南被氧化，又可以使用最小的溶劑量，加快薄膜過濾法的過濾速度，提高工作效率。

《中國藥典分析檢測技術指南》[8]指出，方法適用性試驗的供試品用量可以是指接種到培養基中所需的檢驗量，而不一定要取滿足供試品的檢驗數量。所以在制備供試品過程中，氨曲南原料藥和注射用氨曲南取樣量采用滿足檢驗量的要求，但檢驗數量不做要求。在藥品無菌檢查中，對抑菌性供試品可以使用適宜的中和劑消除抑菌成分，使用的中和劑不應與培養基發生反應，不應改變培養基原有性狀，不應對結果判斷產生影響[9]。本研究在摸索無菌檢查方法過程中，采用600萬單位青霉素酶作為中和劑，中和劑對照組的菌種與陽性對照組的菌種一樣生長良好，表明600萬單位青霉素酶能滿足作為中和劑的要求。研究報道[10]，氨曲南無菌檢查法采用薄膜過濾法結合添加青霉素酶作為中和劑，但本研究中因樣本和試劑耗材來源的不同，采用500 ml沖洗量無法實現大腸桿菌的回收。濾膜對藥物的吸附性起著關鍵的作用，過濾抗生素應盡量選擇低吸附性的濾器和濾膜[8]。本研究采用浙江泰林生物技術股份有限公司提供的KDGB330、NKF330一次性封閉式集菌培養器，采用尼龍膜材質濾膜，適用于強抑菌性的抗生素藥液。

本研究采用的無菌檢查用培養基均通過技術驗證，根據中國藥典[12]要求，進行培養基適用性試驗，包括無菌檢查和靈敏度檢查，并根據供試品特性選擇陽性對照菌，對抗G-菌為主的供試品應以大腸桿菌為對照菌。同時，《中國藥典分析檢測技術指南》[8]規定，若檢驗程序或產品發生變化可能影響檢驗結果時，應重新進行方法適用性試驗。產品的適用性試驗除規定的情況外，還應建立定期再確認的制度，對所選方法和所用條件進行挑戰性試驗來確認，以防止未覺察的影響因素對無菌檢查結果的干擾。本產品可以選擇最敏感的大腸桿菌作為再確認的試驗菌，并在后續生產過程中累積數據，通過長期跟蹤維持或改進工藝，保證產品質量[11]。