糞便SDC2 和NDRG4 基因甲基化檢測在結直腸癌篩查中的應用分析

金文文，張 曉，劉 龍，周 瓊，毛玉環，譚咸操，譚黎明

（湖南師范大學附屬第一醫院/湖南省人民醫院，長沙 410000）

引言在全球范圍內，結直腸癌是三大最常見的惡性腫瘤，也是癌癥死亡率的重要原因之一［1，2］。在中國，由于人們生活水平的提高，飲食習慣發生改變，結直腸癌的發病率和死亡率成逐年增長趨勢，在中國的發病率和死亡率居于第二位和第五位。結直腸癌早期通常無臨床癥狀，大約5%的早期結直腸癌可以得到確診，多數患者確診時已屬于中、晚期［3］，其治療及預后情況不佳；而早期及時發現、早治療5 年生存率可達90%，所以，結直腸癌的早發現、早診斷是降低結直腸癌患者的發病率和死亡率的關鍵。因此，加強中國結直腸癌篩查及發現合適有效的篩查方法，從而提高早期腫瘤的檢出率和降低病死率有重要意義。近年來，腫瘤標記物的聯合檢測對提升腫瘤早期診斷在臨床應用中較為多見。我國的一項研究結果表明血清AFP、CEA 及CA125 的聯合檢測可明顯提高原發性肝癌的陽性檢出率［4］。糞便基因甲基化作為一種易保存、高檢出率、靈敏度較高、特異性較好的無創性結直腸腫瘤標志物，能通過其陽性結果對疑似病例進行進一步檢測，可作為篩查診斷結直腸腫瘤的一種重要的輔助手段。結直腸細胞更新速度比較快，一般每天結直腸脫落細胞大約有1010 個，與正常大腸黏膜相比，結直腸癌時的大腸黏膜脫落細胞數量更多，所以通過分析糞便脫落癌細胞和游離DNA 甲基化的狀況可進行有效的大腸癌篩查［5-6］。SDC2 為syndecan 家族，可以編碼完整的膜蛋白，該膜蛋白被高度糖基化以充當細胞外基質成分的受體。在結直腸癌中，SDC2 基因啟動子區發生異常甲基化，可做為腫瘤標志物用于結直腸癌的篩查［7-10］。NDRG4（N-mycdownstream-regulatedgene4）為抑癌基因NDRG 基因家族成員，此基因家族在人體多數其他正常組織中高表達，在一些腫瘤組織中，NDRG4 不表達或低表達，而低表達則可能與DNA 啟動子區域的高甲基化相關。該基因5'端調控區域內含有的CpG 島容易在結直腸癌發生發展過程中被檢出甲基化狀態［11-12］。因此，本研究作為研究對象，旨在通過對糞便SDC2 和NDRG4 基因甲基化檢測與結直腸癌的關聯性，來判斷人糞便SDC2 和NDRG4 基因在結直腸癌篩查中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 病例選擇與一般資料選擇 湖南省人民醫院2020年9 月1 日～2020 年12 月31 日期間住院收治的結直腸癌高危人群共32 例作為研究對象，年齡30～85 歲，其中男性16 例，女性16 例。納入標準：①有大便習慣改變（慢性腹瀉，慢性便秘）；大便性質改變（粘液便，便血）；大便次數增多，＞3/天，腹部固定部位疼痛的患者；②原因不明的貧血患者；③有炎癥性腸病病史；④有結直腸癌家族病史；⑤有腸息肉的患者；⑥大腸癌手術后的患者。收集其新鮮糞便標本置-20℃保存備用。本研究經醫院倫理委員會討論通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 NDRG4 和SDC2 基因甲基化檢測試劑購自人和未來生物科技（長沙）有限公司，癌胚抗原（carcinoembryonicantigen，CEA）檢測試劑購自蘇州豐泰醫療用品貿易有限公司，糖類抗原19－9（carbohydrateantigen199，CA19-9）檢測試劑購自北京健安生物科技有限公司，DJE-9 基礎電泳儀購自北京中慧天誠科技有限公司，C1000TMPCR 儀、GelDocTM EZSystemDE 等購自BIO-RAD 公司，全自動電化學發光免疫分析儀（GBI-MAP800）購自武漢華大基因生物醫學工程有限公司，QIAampDNAStoolMiniKit（51604）、EpiTectBisulfiteKits（59104）等購自德國Qiagen 公司，Premix Taq（Ex Taq Version 2.0 plus dye）和TaKaRaEpiTaqTMHS（forbisulfite-treatedDNA）等購自Takara 公司，引物由引物由人和未來生物科技（長沙）有限公司合成。

1.3 檢測方法

1.3.1 甲基化NDRG4 和SDC2 檢測 每個受檢者領取一份糞便收集盒，受檢者在醫院按要求取5g 糞便放入糞便收集盒。嚴格按照試劑說明書進行檢測，使用糞便DNA 提取試劑盒從糞便樣本中提取基因組DNA，使用亞硫酸氫鹽轉化試劑盒將基因組DNA 進行修飾，所有未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過計算NDRG4、SDC2 基因與內標基因ACTB 的擴增Ct 比差值是否在判定臨界值內，判斷甲基化水平。

1.3.2 腫瘤標志物檢測 受檢者均采取空腹靜脈血3mL，進行離心處理，3800r／min，離心5min，血清CEA、CA19-9 采用全自動電化學發光免疫分析儀以及試劑為儀器配套試劑。正常參考值為：CEA ≤5ng／mL，CA19-9 ≤35U／mL。

1.4 結果判斷 本試劑盒的陽性判斷值為：當內標基因ACTB 檢測Ct 值≤37 時，SDC 檢測Ct 值≤41.64 或NDRG4 檢測Ct 值≤36.07，檢測結果為陽性；當內標基因ACTB 檢測Ct 值≤37 時，SDC2 檢測CT 值>41.64 或無CT 值，且NDRG4 檢測CT 值>36.07 或無CT 值，檢測結果判定為陰性；當內標基因ACTB 檢測Ct 值>37或無CT 值時，檢測結果無效，需重新檢測。

1.5 統計學方法采用 用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析。計數資料以百分比表示，采用χ2檢驗，采用ROC 曲線來評判靈敏度及特異度，當P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糞便SDC2 基因甲基化水平分析 表1 示，結直腸癌術后化療組、結直腸息肉組和結直腸癌組糞便SDC2 基因甲基化陽性檢出率差異有統計學意義，χ2=25.433，P<0.001，組間比較發現，結直腸癌組SDC2基因甲基化陽性檢出率高于結直腸癌術后化療組、結直腸息肉組，差異有統計學意義。NDRG4 基因甲基化水平分析表2 示，結直腸癌術后化療組、結直腸息肉組和結直腸癌組糞便NDRG4 基因甲基化陽性檢出率差異有統計學意義，χ2=8.983，P<0.05，組間比較發現，結直腸癌組NDRG4 基因甲基化陽性檢出率高于結直腸癌術后化療組、結直腸息肉組，差異有統計學意義。SDC2/NDRG4 基因甲基化水平分析表3 示，結直腸癌術后化療組、結直腸息肉組和結直腸癌組糞便SDC2/NDRG4 基因甲基化陽性檢出率差異有統計學意義，χ2=25.433，P<0.001，組間比較發現，結直腸癌組SDC2/NDRG4 基因甲基化陽性檢出率高于結直腸癌術后化療組、結直腸息肉組，差異有統計學意義。

表1 各組患者糞便SDC2甲基化檢測結果比較

表2 各組患者糞便NDRG4甲基化檢測結果比較

表3 各組患者糞便SDC2、NDRG4甲基化檢測結果比較

2.2 血清腫瘤標志物水平分析 表4 示，結直腸癌術后化療組、結直腸息肉組和結直腸癌CA19-9 陽性檢出率差異無統計學意義。表5 示，結直腸癌術后化療組、結直腸息肉組和結直腸癌CEA 陽性檢出率差異有統計學意義，χ2＝13.411，P<0.05。組間比較顯示，結直腸癌組CEA 陽性檢出率高于結直腸癌術后化療組、結直腸息肉組，差異有統計學意義。表6 示，結直腸癌術后化療組、結直腸息肉組和結直腸癌CA19-9/CEA 陽性檢出率差異有統計學意義，χ2=14.129，P<0.05。組間比較顯示，結直腸癌組CA19-9/CEA 陽性檢出率高于結直腸癌術后化療組、結直腸息肉組，差異有統計學意義。

表4 各組患者血清腫瘤標志物CA19-9檢測結果比較

表5 各組患者血清腫瘤標志物CEA檢測結果比較

表6 3組患者血清腫瘤標志物CEA/CA19-9檢測結果比較

2.3 糞便基因甲基化及血清腫瘤標志物曲線下面積分析 SDC2/ NDRG4、NDRG4、SDC2 基因甲基化檢測特異度高于CEA、CA19-9、CEA/CA19-9，NDRG4 特異度最高。SDC2/ NDRG4、SDC2 基因甲基化檢測靈敏度高于NDRG4、CEA、CA19-9、CEA/CA19-9。SDC2/NDRG4，SDC2 檢測陽性預測值及陰性預測值最高。分析ROCAUC 示，SDC2 和NDRG4 甲基化聯合檢測最高，其次為SDC2 基因檢測。

表7 結直腸癌患者糞便SDC2、NDRG4、SDC2/NDRG4及CEA/CA19-9檢測效果比較

圖1 3組受試者的SDC2甲基化（45-Ct）

圖2 3組受試者的NDRG4甲基化（45-Ct）

3 討論

根據IARC 發布的2020 年全球最新癌癥統計數據顯示，直腸癌新發病例數和死亡病例數分別位于所有惡性腫瘤的第三位和第二位。目前結腸鏡是早期發現腸癌的最重要的檢查，其敏感度及特異度最好，但是結腸鏡作為侵入性檢查，檢查過程中要求患者做腸道準備及存在暴露隱私等缺點，使其難以廣泛應用于篩查。還有一些檢測方法如糞便隱血試驗、直腸指檢、腫瘤標記物檢測、結腸CT 等，均存在不同程度的敏感度低及特異度不高的缺點。CEA、CA19-9 等血清學腫瘤標志物是CRC 臨床輔助診斷和預后判斷中常見的方式，但特異性不高，使其在臨床診斷的應用中價值不高。SDC2 、NDRG4 基因甲基化是CRC 重要的生物學特征［13-16］，因此通過分析糞便中游離DNA 甲基化的狀況可以進行有效的結直腸癌篩查。在糞便樣本中檢測特定基因的DNA 甲基化是實現結直腸癌檢測的一種有潛力的選擇［17-18］，近來發布的直腸癌篩查指南中提出要將糞便DNA 檢測作為理想的篩查技術。DNA 甲基化是表觀遺傳學的主要范疇，可以通過各種機制來影響不同基因的表達，在結直腸癌的形成和發展過程中有著重要意義［19-21］。本研究結果顯示，結直腸癌組糞便基因SDC2 、NDRG4 陽性檢出率顯著高于結直腸癌術后化療組、直腸息肉組，說明糞便基因SDC2 、NDRG4甲基化檢測可作為結直腸癌患者篩查的有效指標；結直腸癌組陽性檢出率顯著高于術后化療組，說明糞便基因SDC2 、NDRG4 甲基化檢測不僅有助于結直腸癌手術效果的評價，還能用于監測疾病的復發。糞便基因SDC2/ NDRG4、NDRG4、SD2 甲基化檢測特異度高于CEA、CA19-9、CEA/CA19-9。SDC2/ NDRG4，SDC2 檢測陽性預測值及陰性預測值最高。同樣根據ROCAUC分析顯示，SDC2 和NDRG4 甲基化聯合檢測最高，說明SDC2 、NDRG4 甲基化聯合檢測可作為CRC 篩查的有效指標。聯合糞便基因SDC2 、NDRG4 甲基化檢測優于CEA 聯合CA19-9 的診斷效能。糞便基因SDC2 、NDRG4 甲基化檢測有助于CRC 患者的篩查及預后，對于指導臨床診療工作有重大意義。由于該研究中樣本量有限，要進一步證實SDC2 、NDRG4 甲基化水平與結直腸癌發展及預后的關聯性還需要開展更多大樣本研究。

圖3 NDRG4、SDC2及由Logistic回歸所得預測概率P的ROC曲線