新風膠囊對佐劑關節炎大鼠滑膜M1/M2巨噬細胞極化的影響

趙磊 萬磊 劉健 黃傳兵 馬熙檬 朱子衡

摘要：目的 觀察新風膠囊對佐劑關節炎（AA）大鼠滑膜M1/M2巨噬細胞極化的影響。方法 將大鼠隨機均分為正常（NC）組、模型（MC）組和新風膠囊（XFC）組，每組10只，除正常組外，MC組和XFC組構建成AA大鼠模型。致炎后第12 d開始給藥，給藥30 d后，檢測各組大鼠關節炎指數（AI），電鏡觀察滑膜超微結構，ELISA檢測血清細胞因子的表達，流式細胞術檢測大鼠外周血炎癥極化標志物CD86+細胞、CD206+細胞的表達。結果 與NC組相比，MC組大鼠AI、IL-1、CD86+細胞的表達升高，IL-10、CD206+細胞的表達降低差異均具有統計學意義（P<0.05，P<0.01）;與MC組大鼠相比，XFC組大鼠AI、IL-1、CD86+細胞的表達降低，IL-10、CD206+細胞的表達升高差異均具有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。結論 新風膠囊可能通過調節M1/M2巨噬細胞極化改善佐劑關節炎大鼠關節炎癥。

關鍵詞：佐劑關節炎;巨噬細胞極化;新風膠囊

中圖分類號：R285.5?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2022）01-0062-05

Effect of Xinfeng Capsule on Polarization of Synovial M1/M2 Macrophagesin Rats with Adjuvant Arthritis

ZHAO Lei1， WAN Lei2， LIU Jian1， HUANG Chuan-bing1， MA Xi-meng1， ZHU Zi-heng1

（1. Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230038， China;2. The First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Anhui 230031， China）

【Abstract】Objective： To observe the effect of Xinfeng Capsule on the polarization of synovial M1/M2 macrophages in adjuvant arthritis （AA） rats. Methods： The rats were randomly divided into normal （NC） group， model （MC） group and Xinfeng Capsule （XFC） group， 10 rats per group. Except for the normal group， the MC group and XFC group were made into AA rat models. The administration was started on the 12th day after the inflammation， and 30th day after the administration， and the arthritis index （AI） of each group was measured. The ultrastructure of the synovial membrane was observed under electron microscope， the expression of serum cytokines was measured by ELISA， and the expression of CD86+ cells and CD206+ cells in the peripheral blood of the rats was measured by flow cytometrym， which are markers of inflammatory polarization. Results： Compared with that of the NC group， the expression of AI， IL-1 and CD86+ cells of the MC group increased， and the expression of IL-10 and CD206+ cells decreased， and the difference was statistically significant （P<0.05， P<0.01） and compared with that of the MC group， the expression of AI， IL-1， and CD86+ cells of the XFC group decreased， and the differences of the increased expression of IL-10 and CD206+ cells were statistically significant （P<0.05， P<0.01）. Conclusion： Xinfeng Capsule may improve the joint inflammation of adjuvant arthritis rats by regulating the polarization of M1/M2 macrophages.

【Key words】Adjuvant Arthritis; Macrophage Polarization; Xinfeng Capsule

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是最常見的慢性風濕性炎癥性疾病，估計在成年人群中的患病率為 0.24%-1.25%，其特征是明顯的滑膜增生和關節滑膜炎，這是炎癥細胞因子顯著過量產生引起的骨和軟骨破壞的結果。未經治療，RA 可能導致嚴重的進行性關節破壞[1-2]。M1 巨噬細胞表面標志物為CD80+細胞，參與炎癥的誘導和惡化，并表達包括IL-1在內的促炎細胞因子。另一方面，M2 巨噬細胞表面標志物為CD206+細胞，通過產生IL-10在內的抗炎細胞因子的表達來參與抗炎反應[3]。IL-1是炎癥區域的有效細胞因子，在調節先天免疫和適應性免疫之間的交互方面很重要，并在炎癥反應的激活和調節等機制中發揮核心作用，通過激活破骨細胞導致骨侵蝕，從而造成骨破壞，加速RA的進展[4-5]。IL-10 被稱為免疫調節細胞因子，IL-10可促進M2型巨噬細胞的極化，同時極化的M2型巨噬細胞會分泌更多的 IL-10，促進血管生成、組織重塑和修復，減輕炎癥反應[6]。研究發現[7-8]，新風膠囊（XFC）能調控炎性細胞因子，通過下調IL-1、上調IL-10的表達，明顯改善RA患者臨床癥狀，也能降低佐劑關節炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠免疫炎癥反應，調節炎癥極化狀態，從而抑制免疫、炎癥反應，抑制軟骨破壞，達到治療RA的作用。本文通過研究新風膠囊對AA大鼠關節炎指數、滑膜超微結構、滑膜M1/M2巨噬細胞分泌因子（IL-1、IL-10）及滑膜M1/M2巨噬細胞表面標志物的影響，探討新風膠囊調節佐劑關節炎大鼠滑膜M1/M2巨噬細胞極化的的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級SD雄性大鼠30只，體質量（190±20）g。由安徽醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：Lscxk（皖）2017-001。動物倫理編號：AHUCM-rats-2021022。

1.1.2 藥物與試劑 新風膠囊（安徽中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心，批號：191015）;IL-1、IL-10試劑盒（武漢基因美公司，貨號分別為JYM0419Ra、JYM0651Ra）;CD86-PE、CD206-AF647試劑（美國santa cruz生物技術公司，貨號分別為SC-19617、SC-20060）。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及給藥 按照隨機對照表將將30只大鼠隨機分為正常（NC）組、模型（MC）組和新風膠囊（XFC）組，每組10只。除NC組外，MC組和XFC組大鼠構建成佐劑關節炎大鼠模型[9]。致炎后第12 d開始給藥，XFC組（0.034 g/mL）：大鼠按1 mL/100 g灌胃，1次/d;NC組及MC組：生理鹽水1mL/100 g灌胃，1次/d。各組連續用藥30 d。

1.2.2 大鼠關節炎指數的測定 在造模后1 d、給藥后30 d測量各組大鼠關節炎指數[10]。

1.2.3 電鏡觀察大鼠滑膜超微結構 大鼠滑膜組織固定、脫水、包埋，組織進行超薄切片，透射電鏡觀察攝片。

1.2.4 ELISA法檢測大鼠血清細胞因子IL-1、IL-10的表達 腹主動脈采血，離心取上清液，操作步驟依照ELISA試劑盒說明。

1.2.5 流式細胞術檢測大鼠外周血炎癥極化標志物CD86+細胞、CD206+細胞的表達 大鼠新鮮血液100μL，按每106個細胞/管分別加入抗鼠M1型巨噬細胞標志物（CD86-PE）、M2型巨噬細胞標志物（CD206-AF647）（0.25μg）/抗鼠。按照說明書操作，上EPICS型流式細胞儀檢測。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS24.0統計軟件分析，實驗數據以（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 新風膠囊對AA大鼠關節炎指數的影響 與NC組相比，MC組AA大鼠Al表達顯著升高;與MC組比較，XFC組Al表達顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01，表 1）。

2.2 新風膠囊對AA大鼠滑膜超微結構影響 電鏡下NC組滑膜細胞線粒體無變形、腫脹，粗面內質網豐富，核膜邊界清楚，染色質分布均勻，嵴突排列規整;MC組滑膜細胞呈變形、腫脹，線粒體腫脹肥大并破壞，粗面內質網減少、破壞，核膜不完整，邊界不清，染色質分布不均，嵴突排列不規整、部分消失;XFC組滑膜細胞線粒體少量呈變形、腫脹，粗面內質網較多，核膜邊界較清楚，染色質較均勻，大部分嵴突排列完整（圖1）。

2.3 新風膠囊對AA大鼠滑膜M1/M2巨噬細胞分泌因子（IL-1、IL-10）的影響 與NC組相比，MC組細胞因子IL-1表達升高，IL-10表達降低;與MC組比較，XFC組IL-1表達降低，IL-10 表達升高，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01，表2）。

2.4 新風膠囊對AA大鼠滑膜M1/M2巨噬細胞表面標志物影響 與NC組相比，MC組AA大鼠M1表面標志物CD86+細胞表達升高，CD206+細胞表達降低;與MC組比較，XFC組CD86+細胞表達降低，CD206+細胞表達升高，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01，表3，圖2，圖2）。

3 討論

RA是一種自身免疫性炎癥性關節疾病，巨噬細胞在RA的滑膜中聚集，巨噬細胞可在不同因素的誘導下由M1型和M2型之間相互轉換，這就是巨噬細胞極化現象。在RA的發生發展過程中，M1和M2型巨噬細胞之間的動態平衡被打破，M1型促炎巨噬細胞的比例高于M2型抗炎巨噬細胞，造成比例失衡，導致IL-1等炎癥細胞因子的分泌和炎癥反應的加劇，加速機體炎癥反應，造成局部和全身性骨丟失，最終導致關節侵蝕和破壞[11-13]。

在炎癥反應的早期階段，在應對微生物挑戰以及各種炎癥因子的刺激下，巨噬細胞能極化形成M1巨噬細胞，M1巨噬細胞可分泌大量促炎性細胞因子（如IL-1），滑膜細胞和軟骨細胞中的 IL-1信號傳導導致降解軟骨的基質金屬蛋白酶的上調和分泌，此外，當存在T細胞衍生的核因子-κB受體活化因子配體時，IL-1會發揮促破骨細胞作用，激活成纖維細胞和破骨細胞，加速機體炎癥反應，導致骨侵蝕，造成關節破壞和進一步的關節損傷[14-15]。調節性T細胞、調節性B細胞是具有抗炎和抗凋亡特性的特殊細胞，這些細胞可以通過多種機制減少炎癥引起的組織損傷并創造適當的免疫微環境，同時通過IL-10影響巨噬細胞極化來發揮其免疫調節作用[16]。IL-10是一種關鍵的抗炎細胞因子，由活化的免疫細胞產生，IL-10誘導的M2型巨噬細胞具有減輕炎癥、吞噬功能、產生細胞外基質成分、血管生成和趨化因子產生的作用，同時能調節CD4+、CD8+T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞等免疫細胞的活性，可以起到抗炎作用[17]。IL-10 可通過抑制破骨細胞生成來維持骨骼健康，在 IL-10 缺陷小鼠中進一步強調了IL-10的重要性，其中觀察到骨質疏松癥的所有標志，即骨量減少、機械脆性增強和骨形成減少[18]。

中藥新風膠囊（黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤組成）具有健脾益氣、化濕通絡功效，應用于臨床療效確切[19-20]。本研究發現，經新風膠囊治療后，AA大鼠關節炎指數得到顯著改善，炎性細胞因子IL-1水平及CD80+細胞顯著降低，抗炎細胞因子IL-10水平及CD206+細胞表達顯著升高，說明新風膠囊可能通過調節M1/M2巨噬細胞極化進而下調IL-1、上調IL-10水平的表達，從而改善佐劑關節炎大鼠關節炎癥。

綜上所述，新風膠囊可能通過調節M1/M2巨噬細胞極化改善佐劑關節炎大鼠關節炎癥。

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（收稿日期：2021-10-29）