辣椒素通過腸道菌群改善DSS誘導的小鼠結腸炎

郭雪,徐婧,徐豪明,張艷,黃琛,聶玉強,周永健,周有連

【提要】目的 探討不同劑量的辣椒素對小鼠潰瘍性結腸炎腸道炎癥和腸道菌群的影響。方法 將25只清潔級6～8周齡C57小鼠隨機分為正常對照組、葡聚糖硫酸鈉(DSS)組、辣椒素(5 mg/kg CAP)+DSS組、辣椒素(10 mg/kg CAP)+DSS組、辣椒素(20 mg/kg CAP)+DSS組，每組5只。通過自由飲用3% DSS水誘導小鼠結腸炎模型。在DSS干預前7 d，每天給予200 μL相應劑量的辣椒素灌胃，至干預的第8天處死。觀察記錄小鼠體質量、疾病活動指數(DAI)、測量結腸長度；利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)和蛋白印跡(WB)檢測結腸組織的炎癥因子及腸道屏障的基因轉錄水平以評估辣椒素對結腸炎小鼠的作用；并通過糞便16S rRNA測序檢測小鼠腸道菌群。結果 辣椒素在一定范圍內，成劑量依賴性改善小鼠腸炎大體，下調促炎癥因子IL-6、IL-18的表達，增強腸道屏障ZO-1、MUC2、Tff3、Occludin的表達；并可重塑腸炎腸道菌群組成，改變菌群相對物種豐富度。結論 辣椒素在合適的劑量范圍內可有效改善小鼠結腸炎，并調整小鼠腸道菌群結構。

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的一種，是一種慢性非特異性腸道炎癥，病因不明，臨床治療效果不佳，多認為與遺傳易感因素、環境因素、免疫因素及腸道菌群改變有關[1]。IBD患者的腸道菌群紊亂常以有益菌的減少及有害菌的增多為特征，臨床上也嘗試使用糞菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)技術重塑患者腸道菌群治療UC，但其療效目前仍存在爭議[2]。辣椒是一種藥食兩用的草本植物，可用作飲食調味劑和中草藥，具有悠久的歷史[3]。辣椒素是辣椒的主要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、鎮痛、增強造血干細胞動員等作用[4-6]。目前，辣椒素對IBD的影響尚存在爭議且辣椒素影響腸道菌群的研究報道尚少。本研究使用葡聚糖硫酸鈉(DSS)構建腸炎小鼠模型，給予小鼠不同劑量的辣椒素干預，通過評估小鼠的體重、疾病活動指數(disease activity index, DAI)、炎癥因子及黏膜屏障的表達、糞便菌群變化，探討辣椒素對DSS 誘導結腸炎的療效,并初步探討辣椒素改善腸炎與腸道菌群的關系。

1 材料及方法

1.1 動物及主要試劑

1.1.1 動物 25只清潔級8～10周齡、體重為22～25 g的雄性C57小鼠，購自廣東省醫學實驗動物中心并飼養于華南理工大學附屬第二醫院(廣州市第一人民醫院)26 ℃恒溫動物實驗室【實驗動物生產許可證號為SCXK(粵)2022-0002】。相關動物方案經過華南理工大學附屬第二醫院(廣州市第一人民醫院)管理委員會批準。

1.1.2 試劑及儀器 DSS購自美國MP Biomedical公司；辣椒素購自MCE (HY-10448); RNA later、Trizol、購自美國Thermo Fisher Scientific公司；PCR逆轉錄試劑盒及TB Green Premix Ex TaqⅡ購自日本Takara公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；普通PCR儀、Nanodrop2000微量分光光度計購自美國Thermo Fisher Scientific公司；實時熒光定量PCR儀為德國Analytik Jena公司產品；Occludin抗體購自美國Proteintech Group公司(貨號：27260-1-AP)；MUC2抗體購自愛博泰克生物公司(貨號：A4767)。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣椒素溶液配置 根據試劑說明書，加入無水乙醇溶解為100 mg/mL儲備液，-80 ℃冰箱保存，小鼠灌胃前加入適量玉米油，配置為相應的工作液濃度。

1.2.2 結腸炎小鼠模型的建立與取材 小鼠在12 h晝夜交替、26 ℃環境適應性飼養一周。將25只清潔級6～8周齡C57小鼠隨機分為空白對照組(正常對照組)、葡聚糖硫酸鈉組(DSS組)、辣椒素(5 mg/kg)+DSS組(DSS+CAP5)、辣椒素(10 mg/kg)+DSS組(DSS+CAP10)、辣椒素(20 mg/kg)+DSS組(DSS+CAP20)，每組5只。DSS干預方案：予小鼠含DSS(質量體積分數為3%)的飲用水連續、自由飲用7 d，構建小鼠急性結腸炎模型。辣椒素給藥方案：DSS造模前7 d，治療組每天給予相應濃度的辣椒素200 μL灌胃，DSS組予相應劑量的PBS灌胃，至DSS造模結束，共14 d。每天定時稱量小鼠的體重，觀察并記錄糞便性狀及隱血情況。結束造模采用頸椎脫臼法處死。取回腸、結腸及直腸拍照測量。取出盲腸內容物，于-80 ℃保存，用于16S rRNA測序。

1.2.3 DAI評分 根據趙亞妮等[7]的評分標準，在DSS造模期間，每日記錄小鼠體重，糞便性狀及血便情況：每日體重與初始體重相比，體重下降百分比為0～1%計0分，1%～5%計1分，5%～10%計2分，10%～15%計3分，≥15%計4分；糞便性狀無異常計0分，糞便松散計2分，稀便計4分；糞便隱血試驗陰性計0分，糞便隱血試驗陽性計1分，肉眼血便計2分。根據癥狀評分計算DAI：DAI=(體重下降得分+糞便性狀得分+糞便隱血或肉眼血便得分)/3。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time qPCR) 根據Trizol試劑說明書，對腸組織進行研磨，提取RNA并檢測純度和濃度，稀釋為相應濃度；根據逆轉錄試劑說明書進行逆轉錄，采用SYBR Green按照95 ℃預變性30 s，95 ℃變性15 s，40個循環；60 ℃退火1 min，40個循環；95 ℃ 1 s；Melt，6 s反應進行擴增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，按照2-ΔΔCT法進行定量分析。

1.2.5 小鼠腸道16S rRNA測序 用DNA抽提試劑盒提取糞便DNA，并使用通用引物515F (5′-GTGCCAGCMGCCGC-GGTAA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 進行樣本16S rRNAV4區PCR擴增，基于IonS5TM XL測序平臺進行高通量測序(北京諾禾致源科技股份有限公司提供技術支持)，應用Silva132數據庫進行物種注釋。選取各組門、科水平相對豐度前10位的物種繪制堆疊圖，分析物種組成。利用線性判別分析效應量(linear discriminantanalysis effect size，LEfSe)差異分析算法篩選出各組差異有統計學意義的優勢菌[線性判別式分析(lineardiscriminant analysis, LDA)評分≥4 log10][8]。

1.2.6 蛋白印跡(Western blot) 取小鼠結腸經RIPA+蛋白酶抑制劑+磷酸酶抑制劑混合液勻漿裂解，后用BCA法測定蛋白濃度，配制10%的聚丙烯凝膠，經電泳、轉膜后，用脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃過夜，抗體濃度為Occludin (1∶1 000)、MUC2(1∶500)；復溫后，二抗孵育1 h，TBST清洗后，顯影。

1.3 統計學方法

應用SPSS 26和ImageJ 1.52軟件進行統計學分析，Graphpad Prism 9.4.0和Adobe Illustrator 2021繪圖。兩組間比較用兩樣本t檢驗，多組間采用單因素方差分析，重復測量計量資料采用重復測量方差分析。P<0.05有統計學差異。

2 結果

2.1 辣椒素緩解小鼠體重下降，改善DAI評分

空白對照組小鼠一般情況良好，體質量平穩上升，DAI在0分上下波動，DSS組小鼠在造模4天后開始出現活動度減少、毛色暗淡、體重下降等現象，癥狀逐漸加重，出現腹瀉、肉眼血便。從第4天起，體重下降與正常組小鼠相比出現統計學差異(第4天：P<0.05；第5、6、7天：P均<0.001)。給予辣椒素干預的治療組中，小鼠體重下降程度均低于DSS組，且與辣椒素劑量成正比。如圖1A所示，與模型組相比，給予20 mg/kg劑量的辣椒素組，體重下降在造模的第5、6、7天均有統計學差異(P均<0.01)，給予10 mg/kg劑量的辣椒素組，在第7天有統計學差異(P<0.01)，5 mg/kg的辣椒素組無統計學差異，但可見減緩體重下降的趨勢。實驗終點時，空白組小鼠疾病活動程度趨近于0，DSS組小鼠DAI顯著升高(P<0.0001)，給予辣椒素干預后DAI降低。如圖1B所示，末次(第7天)DAI評分中，20 mg/kg CAP+DSS組DAI下降最為明顯，有統計學差異(P<0.01)，10 mg/kg組有下降趨勢，但無統計學意義(P>0.05)。

圖1 各組小鼠的體質量下降百分比及末次DAI評分 A：體質量下降百分比；B：末次DAI評分(注釋：#表示模型組與正常組相比；*表示辣椒素干預組與模型組相比；#：P<0.05；##：P<0.01；###：P<0.001；####：P<0.0001；*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；****：P<0.0001)

2.2 辣椒素降低小鼠死亡率及緩解腸炎小鼠的結腸縮短與病理損傷

與正常組相比，DSS組結腸長度明顯縮短(P<0.001)，給予辣椒素干預后，結腸縮短有改善，其中以20 mg/kg劑量組最為顯著(P<0.01，圖2A和B)；在DSS造模的第6天，模型組小鼠1只出現死亡，第7天，5 mg/kg劑量辣椒素組出現1只死亡，其余組全部存活。對照組小鼠結腸黏膜完整，腺體結構排列整齊，杯狀細胞豐富，固有層無明顯中性粒細胞浸潤，而腸炎模型組小鼠結腸上皮完整性損害嚴重，上皮細胞破壞，腺體缺損，黏膜固有層可見中性粒細胞浸潤嚴重。辣椒素干預后，可不同程度緩解上皮的破壞，部分腺體恢復，杯狀細胞數量增加，但病理評分未見差異(圖2C-H)。

圖2 各組小鼠結腸長度及HE染色 A：結腸大體；B：結腸長度統計； C：正常對照組；D：DSS組；E：5 mg/kg辣椒素干預組；F: 10 mg/kg辣椒素干預組； G: 20 mg/kg辣椒素干預組；H：組織病理評分(#表示模型組與正常組相比；*表示辣椒素干預組與模型組相比，DSS+CAP5和DSS+CAP20各只小鼠評分相同)

2.3 辣椒素降低小鼠炎癥并增強腸道屏障

利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time qPCR)檢測結腸組織的炎癥因子及黏膜屏障的基因轉錄水平。如圖3A所示，DSS干預后，炎癥因子IL-6、IL-18顯著升高(P均<0.001)；屏障蛋白ZO-1、黏液屏障MUC2表達量顯著降低 (ZO-1：P<0.01；MUC2：P<0.0001)。給予辣椒素干預后，炎癥因子水平與模型組相比顯著下降(10 mg/kg組：IL-6和IL-18：P均<0.0001；20 mg/kg組：IL-6和IL-18：P均<0.0001；IL-1β：P=0.0267)；而屏障蛋白表達量顯著升高(5 mg/kg組：ZO-1，Tff3：P均<0.0001；MUC2:P<0.05；20 mg/kg組：ZO-1和Tff3，P均<0.0001;MUC2,P0.05);與康等人報道結果一致[10]。Western Blot結果顯示(圖3B-C)：DSS干預后，緊密連接蛋白Occludin表達顯著降低(P<0.05)；給予辣椒素干預后，與模型組相比顯著升高(10 mg/kg組和20 mg/kg組：P均<0.01)；黏液蛋白MUC2，辣椒素干預后，有升高趨勢，但無統計學意義。

圖3 炎癥因子及屏障在各組水平 A: 小鼠結腸IL-6、IL-18、IL-1β、ZO-1、MUC2和Tff3 在各組的mRNA相對表達量；B：MUC2和Occludin蛋白在各組的表達量；C：Occludin蛋白表達水平柱狀圖(#表示模型組與正常組相比；*表示辣椒素干預組與模型組相比)

2.4 辣椒素調節小鼠腸道菌群

2.4.1 物種組成分析

在門水平(圖4A)，各組優勢菌門均為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門。厚壁菌門在空白對照組小鼠腸道菌群中的相對豐度為71.17%，在DSS組中水平明顯下降為26.15%，不同劑量辣椒素干預后，水平均較DSS組升高(分別為5 mg/kg：36.57%、 10 mg/kg：53.44%、20 mg/kg：47.58%)；變形菌門在空白對照組小鼠腸道菌群中的相對豐度為10.18%，在DSS組明顯升高為42.78%，不同劑量辣椒素干預后，水平均較DSS組下降(分別為5 mg/kg：17.84%、 10 mg/kg：10.55%、20 mg/kg：13.15%)；擬桿菌門在空白對照組小鼠腸道菌群中的相對豐度為4.79%，在DSS組升高為9.35%，不同劑量辣椒素干預后，水平均較DSS組升高(分別為5 mg/kg：33.62%、 10 mg/kg：19%、20 mg/kg：28.99%)。

在科水平(圖4B)，各組優勢菌科差異較大。腸桿菌科在空白對照組小鼠腸道菌群中的相對豐度為0.88%，在DSS組明顯升高為36.54%；不同劑量辣椒素干預后，水平均較DSS組降低(分別為5 mg/kg：15.62%、 10 mg/kg：6.25%、20 mg/kg：11.17%)；丹毒絲菌科在空白對照組小鼠腸道菌群中的相對豐度為25.80%，在DSS組降低為14.31%，不同劑量辣椒素干預后，水平均較DSS組升高(分別為5 mg/kg：23.21%、 10 mg/kg：28.67%、20 mg/kg：26.79%)；擬桿菌科在空白對照組小鼠腸道菌群中的相對豐度為2.97%，在DSS組升高為3.84%，不同劑量辣椒素干預后，水平均較DSS組升高(分別為5 mg/kg：18.49%、 10 mg/kg：7.19%、20 mg/kg：22.46%)；乳桿菌科在空白對照組小鼠腸道菌群中的相對豐度為19.55%，在DSS組顯著下降為2.26%，其中以10 mg/kg與20 mg/kg的辣椒素干預后，水平較DSS組升高(分別3.68%、 3.38%)；毛螺菌科在空白對照組小鼠腸道菌群中的相對豐度為6.76%，在DSS組降低為1.63%，不同劑量辣椒素干預后，水平均較DSS組升高(分別為5 mg/kg：4.02%、 10 mg/kg：6.91%、20 mg/kg：3.8%)。

圖4 物種相對豐度圖及LEFSe分析 A：物種相對豐度圖：門水平；B：物種相對豐度圖：科水平；C：LDA值分布柱狀圖；D：進化分支圖

2.4.2 LEFSe分析

如圖4 C和D所示：空白對照組出現了大量差異有統計學意義的細菌，包括厚壁菌門(LDA評分=5.328 log10，P=0.046)、梭菌綱(LDA評分=4.828 log10，P=0.049)、乳桿菌目(LDA評分=4.918 log10，P=0.004)、梭菌目UCG-014(LDA評分=4.599 log10，P=0.021)、顫螺菌目(LDA評分=4.335 log10，P=0.008)、芽胞桿菌目(LDA評分=4.121 log10，P=0.012)、乳桿菌科(LDA評分=4.921 log10，P=0.004)、瘤胃菌科(LDA評分=4.344 log10，P=0.011)、芽孢桿菌科(LDA評分=4.11 log10，P=0.007)、木質乳酸桿菌屬：(LDA評分=4.826 log10，P=0.007)、回腸桿菌屬：(LDA評分=4.370 log10，P=0.049)、毛螺菌屬NK4A136_group：(LDA評分=4.208 log10，P=0.012)、乳桿菌屬：(LDA評分=4.167 log10，P=0.016)、桿菌屬：(LDA評分=4.087 log10，P=0.013)、鼠乳桿菌：(LDA評分=4.821 log10，P=0.007)、纈裂芽桿菌種：(LDA評分=4.367 log10，P=0.049)、炭疽桿菌：(LDA評分=4.07 log10，P=0.021)；DSS組出現的有統計學差異的細菌包括疣微菌門(LDA評分=4.605 log10，P=0.017)；疣微菌綱(LDA評分=4.628 log10，P=0.016)、腸桿菌目(LDA評分=5.176 log10，P=0.04)、疣微菌目(LDA評分=4.625 log10，P=0.018)、腸桿菌科(LDA評分=5.164 log10，P=0.018)、阿克曼斯亞科(LDA評分=4.613 log10，P=0.019)、埃希桿菌-志賀菌屬(LDA評分=5.148 log10，P=0.022)、嗜黏蛋白阿克曼菌屬：(LDA評分=4.608 log10，P=0.02)、大腸埃希氏菌(LDA評分=5.155， log10，P=0.022)、嗜黏蛋白阿克曼菌(LDA評分=4.588 log10，P=0.017；5 mg/kg的辣椒素干預后的有統計學差異意義的細菌為擬桿菌門(LDA評分=5.184 log10，P=0.002)；擬桿菌綱(LDA評分=5.144 log10，P=0.002)；擬桿菌目(LDA評分=5.164 log10，P=0.018)；擬桿菌科(LDA評分=4.674 log10，P=0.004)；擬桿菌屬(LDA評分=4.68 log10，P=0.004)； 10 mg/kg的辣椒素干預后出現的有統計學差異的細菌包括毛螺菌目及毛螺菌科(LDA評分=4.463 log10，P=0.034)； 20 mg/kg的辣椒素干預后出現的有統計學差異的細菌包括，消化鏈球菌目(LDA評分=4.276 log10，P=0.011)、消化鏈球菌科(LDA評分=4.264 log10，P=0.016)、羅姆布茨菌屬及羅姆布茨菌種(LDA評分=4.246 log10，P=0.012)、木犀科(LDA評分=4.951 log10，P=0.004)、圖里西桿菌屬(LDA評分=4.538 log10，P=0.031)。

3 討論

近十年來，IBD的患病率逐年上升，具體發病機制尚不明確。學者推測：飲食、心理等多種環境因素作用于遺傳易感者，間接或直接導致腸道菌群紊亂，可引起腸道屏障損傷，誘發免疫系統紊亂，形成局部潰瘍[1]。由此可見：腸道菌群在潰瘍性結腸炎中發揮著不容小覷的作用。而辣椒素的藥理作用在我國已有近百年的研究歷史，已被證明有抗炎[9-10]、抗菌[11-12]、鎮痛[13]、減肥調脂[14]、抗腫瘤[15]、保護消化系統[16]等作用，在我們的研究，辣椒素緩解了DSS誘導的潰瘍性腸炎并調節腸道菌群，這將飲食中的辣椒素與腸道菌群建立聯系。

本實驗用含3% DSS自由飲用水構建小鼠急性腸炎模型，在造模第四天出現體重下降、腹瀉、肉眼血便等癥狀，是UC患者的典型臨床特征。依據DAI評分和結腸縮短可見模型組和正常組小鼠有顯著差異，急性潰瘍性結腸炎造模成功。當給予不同濃度的辣椒素灌胃7天，可見體重下降程度、DAI評分、結腸縮短程度成不同水平的改善，與蔣等人[17]在研究中指出50 mg/kg可防止胃腸道潰瘍的結論一致。在DSS模型組中IL-6，IL-18，IL-1β等促炎因子顯著上調，給予辣椒素干預后炎癥因子顯著下調，可發揮抗炎作用。外周膜蛋白(ZO-1)、黏蛋白MUC2和三葉因子3(Tff3)對于促進腸道穩態與黏膜修復至關重要[18]。我們的研究在基因轉錄水平證明了給予辣椒素干預后可促進腸屏障上調，與曹等人[19]的研究結果一致。

辣椒素作為辣椒的活性代謝產物，可通過口服進入胃腸道，因此，研究其在胃腸道中的作用，特別是對IBD的影響，有很大的臨床意義。先前的研究報道辣椒素可惡化[20]、緩解[21]、或不影響UC[22]的嚴重程度，尚存在爭議。研究報道[23-24]，辣椒素可增加腸黏膜血液灌注或增強造血干細胞動員來預防和治療潰瘍性結腸炎的。本實驗通過構建急性腸炎小鼠，通過灌胃的干預方式模擬辣椒素在人體內的作用途徑，結果表明辣椒素在一定的劑量范圍內成濃度依賴性改善的體重下降、DAI評分、炎癥因子及黏膜屏障水平等指標，但對病理改善不太顯著。本研究中選用的劑量中20 mg/kg效果最為顯著，而有研究報道[25]，辣椒素劑量濃度過大，會對胃腸黏膜造成損害，最佳劑量需要進一步探索。

腸道菌群紊亂是IBD發病的重要機制之一[26]。本研究通過16SrDNA測序分析發現,辣椒素干預后可以增加腸道菌群多樣性，調整DSS小鼠腸道菌群結構，其中產丁酸鹽的理研菌科、毛螺菌屬、羅姆布茨菌屬的相對豐度上調; 并且，辣椒素干預組中升高的木犀菌科、毛螺菌科、理研菌科、擬桿菌科中的均存在利用黏蛋白單糖的成員，其可與腸道致病菌占據同樣生態位(利用黏蛋白單糖)的共生菌去擠占致病菌的生存空間，是潛在的微生態治療策略。Nature Communications[27]發表的一項研究報道了一種方法，在小鼠中鑒定出能利用黏蛋白單糖的多種共生菌，并從中挑選構建了混合菌株群落，能有效抑制艱難梭菌的生長和定植。我們推測辣椒素干預后調整腸道菌群改善腸炎可能與此機制有關。

綜上所述，辣椒素可緩解DSS誘導的小鼠結腸炎癥，改變腸道菌群結構，為以后臨床和基礎研究探索辣椒素對IBD患者的影響提供參考依據。但本研究尚存在以下不足：①本實驗研究對象為雄性小鼠，而有文獻報道雌雄小鼠腸道菌群組成存在差異，可能與性別敏感性有關[28]；②本實驗構建的為急性腸炎模型，辣椒素干預時間較短，而長期慢性模型更能模擬飲食對IBD的影響。本研究辣椒治療IBD提供了一定依據，但辣椒素的具體作用機制仍需大量的探索。