lncRNA MIAT通過miR-203調控NPAS4促進胃癌細胞增殖、侵襲、遷移的機制研究

劉丹，吳瑾，周紅鳳，劉東輝，胡曉薇

【提要】目的 本研究通過體外培養胃癌細胞HGC-27，探究lncRNA MIAT能否通過靶向miR-203調控神經元PAS結構域蛋白4(NPAS4)促進胃癌細胞增殖、侵襲、遷移。方法 體外培養HGC-27與GES-1細胞，qRT-PCR法檢測各細胞中lncRNA MIAT、miR-203、NAPS4 mRNA表達。雙熒光素酶報告基因實驗驗證lncRNA MIAT與miR-203、miR-203與NPAS4之間的靶向關系。將對數生長期HGC-27細胞分組并進行轉染：對照組、si-NC組(轉染si-NC)、si-MIAT組(轉染si-MIAT)、miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-203組(轉染miR-203)、anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC)、anti-miR-203組(轉染anti-miR-203)、si-MIAT+anti-miR-NC組(轉染si-MIAT+anti-miR-NC)、si-MIAT+anti-miR-203組(轉染si-MIAT+anti-miR-203)、pc-NC組(轉染pc-NC)、pc-NAPS4組(轉染pc-NAPS4)、pc-NAPS4+miR-NC組(轉染pc-NAPS4+miR-NC)、pc-NAPS4+miR-203組(轉染pc-NAPS4+miR-203)，qRT-PCR法檢測lncRNA MIAT、miR-203、NPAS4 mRNA表達；MTT法檢測細胞增殖活力；Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲能力；Western blot法檢測MMP-3、MMP-9、CyclinD1、NPAS4蛋白表達。結果 與GES-1細胞比較，胃癌細胞HGC-27中lncRNA MIAT、NAPS4 mRNA表達顯著升高，miR-203表達顯著降低(P<0.05)。雙熒光素酶報告基因實驗證實，lncRNA MIAT能夠靶向miR-203調控NAPS4(P<0.05)。沉默lncRNA MIAT可顯著降低細胞活力以及遷移與侵襲能力，下調MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達，降低NAPS4 mRNA和蛋白表達(P<0.05)；過表達miR-203可顯著降低NAPS4 mRNA和蛋白表達，降低細胞活力以及遷移與侵襲能力，下調MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(P<0.05)；而抑制miR-203表達則與miR-203過表達作用相反，且抑制miR-203表達可顯著逆轉沉默lncRNA MIAT對細胞活力以及遷移與侵襲能力的抑制作用(P<0.05)；過表達NAPS4可顯著促進HGC-27細胞增殖、遷移與侵襲，上調MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(P<0.05)，同時其對細胞惡性行為的促進作用可被miR-203過表達削弱(P<0.05)。結論 沉默lncRNA MIAT可通過靶向miR-203調控NAPS4表達，減弱胃癌細胞增殖、侵襲、遷移等細胞生物學行為過程。

胃癌是一種常見的消化系統惡性腫瘤，其發病率與致死率均較高，嚴重威脅患者生命健康，增加家庭與社會負擔[1]。我國胃癌的發病率遠高于其他國家，盡管胃癌的治療取得了快速進展，但由于放、化療等治療手段的副作用，導致患者預后極差，生存率仍然很低[2-3]。研究發現，胃癌細胞發生惡性增殖、侵襲與轉移是造成治療失敗、患者死亡的主要原因之一[4]，但其潛在機制尚未發現。因此，探究胃癌細胞惡性行為學的發生機制對于胃癌患者治療與預后具有非常重要的意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)可在多種腫瘤細胞中表達異常，并參與調控腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲與遷移等惡性生物學行為，與腫瘤的發生與發展存在密切聯系[5-6]。據研究報道，多種lncRNA在胃癌中異常表達，調控細胞生物學過程[7-8]，可能與胃癌的發生與發展有關。研究發現，血清外泌體來源lncRNA MIAT在胃癌患者體內高表達，可作為胃癌診斷與預后生物標志物[9]。另外，lncRNA MIAT在非小細胞肺癌細胞中呈高表達，敲低其表達能顯著減少細胞增殖，抑制上皮間質轉化等細胞過程[10]。近年來，微小RNA(microRNA, miRNA)在腫瘤中異常表達，參與腫瘤進展，且多種miRNA參與胃癌的發生、發展[11]，其中miR-203在胃癌中低表達，影響胃癌細胞分化、轉移，是胃癌患者預后的獨立危險因素之一[12]。神經元PAS結構域蛋白4(neuronal Per-ArntSim domain protein 4，NPAS4)是一種與神經元興奮相關的轉錄因子，幾乎僅表達于神經系統，參與調節學習行為與記憶形成[13]。有研究稱，NPAS4過表達對LPS誘導的細胞凋亡與炎癥反應具有密切聯系[14]，但其在胃癌細胞表達情況以及對胃癌細胞行為學的影響尚不清楚。本研究通過體外培養胃癌細胞HGC-27，探究lncRNA MIAT能否通過靶向miR-203調控NPAS4促進胃癌細胞增殖、侵襲、遷移。

1 材料

1.1 細胞株與主要試劑

胃癌細胞HGC-27、正常胃黏膜上皮細胞GES-1均購自中國科學院細胞庫；胎牛血清(abs9*)購自愛必信(上海)生物科技有限公司；青鏈雙抗溶液(03-031-5B)購自以色列Bioind公司；RPMI1640培養基(PM150110)購自武漢普諾賽生命科技有限公司；TRIzol試劑(SH-2366)購自北京凱詩源生物科技有限公司；si-MIAT、miR-203模擬物(miR-203)、anti-miR-203、pc-NAPS4及其陰性對照物均購自上海吉瑪制藥有限公司；MTT細胞增殖檢測試劑盒(M8180-1)購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室(3413)購自美國Corning公司；Matrigel基底膠(SJ-JC15426)購自上海機純實業有限公司；MMP-3抗體(ab52915)、MMP-9抗體(ab76003)、CyclinD1抗體(ab16663)、NPAS4抗體(ab242003)、HRP標記羊抗兔二抗(ab205718)均購自英國Abcam公司。

1.2 主要儀器

正置智能型顯微鏡DM4B購自徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司；MyGo Pro二代全光譜便攜式實時熒光定量PCR儀購自英國IT-IS公司；ELx808酶標儀購自美國Lonza公司；IX70熒光倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；Corning?Axygen?凝膠成像系統購自美國Corning公司。

2 方法

2.1 細胞培養

將HGC-27細胞與GES-1細胞培養于含有10%胎牛血清、1%青鏈雙抗的RPMI1640培養基中，置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養箱中培養，每2天更換一次培養基，觀察細胞生長狀態，待細胞融合至80%以上時，進行傳代培養，取對數生長期細胞進行后續實驗。

2.2 qRT-PCR法檢測lncRNA MIAT、miR-203、NPAS4 mRNA的表達

收集各組對數生長期HGC-27、GES-1細胞，采用TRIzol試劑提取總RNA并逆轉錄得到cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR反應，反應條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共45個循環。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA MIAT、miR-203、NPAS4 mRNA的相對表達量。qRT-PCR反應所需引物序列為：lncRNA MIAT上游引物5′-CATCTTACAACAGACCAGAA-3′，下游引物5′-ACAGTCC-ACAGAACATCCAT-3′；miR-203上游引物5′-GCATGCAGT-ATGTCTATCAG-3′，下游引物5′-ACTAGACTAGATAGTCAG-3′；NPAS4上游引物5′-CAGGATGACTCACACTGACAGT-ATTTTTAG-3′，下游引物5′-GTGGGAGAAGAGCTATTTAT-ATCACCAG-3′；GAPDH上游引物5′-AGAAGGCTGGGGC-TATTG-3′；下游引物5′-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′。所需引物均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

2.3 細胞轉染與實驗分組

取對數生長期HGC-27細胞，稀釋細胞密度為2×105個/孔，接種于6孔板，待細胞融合至80%以上時，將細胞分組：對照組、si-NC組、si-MIAT組、miR-NC組、miR-203組、anti-miR-NC組、anti-miR-203組、si-MIAT+anti-miR-NC組、si-MIAT+anti-miR-203組、pc-NC組、pc-NAPS4組、pc-NAPS4+miR-NC組、pc-NAPS4+miR-203組。采用Lipofectamine 2000轉染試劑盒將si-NC、si-MIAT、miR-NC、miR-203、anti-miR-NC、anti-miR-203、pc-NC、pc-NAPS4按照分組進行轉染。轉染48 h后，先采用qRT-PCR法進行轉染效果的檢測，再進行后續實驗。

2.4 MTT法檢測細胞增殖

收集轉染成功的各組HGC-27細胞，制備細胞懸液，調整細胞密度為1×104個/mL，按照每孔100 μL細胞懸液接種于96孔板中，每組設3個復孔，置于常規培養箱中繼續培養48 h后，每孔中加入20 μL的MTT溶液，置于常規培養箱中繼續孵育4 h，采用酶標儀測定各孔490 nm處OD值。重復測定三次，計算平均值作為細胞活力。

2.5 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲

遷移實驗：收集各組HGC-27細胞，制備細胞懸液，調整細胞密度為1×105個/mL，取100 μL細胞懸液加入Transwell小室的上室，下室中加入常規培養基，每組設置3個復孔，繼續培養24 h后，采用多聚甲醛固定，結晶紫染色，置于倒置顯微鏡下觀察并計數。

侵襲實驗：于Transwell小室的上室鋪上Matrigel基底膠，加入100 μL細胞懸液，下室加入常規培養基，其余操作同遷移實驗。

2.6 雙熒光素酶報告基因實驗

通過生物信息學網站預測可知，lncRNA MIAT與miR-203存在靶向關系，miR-203與NPAS4存在靶向關系。將lncRNA MIAT野生型報告基因載體(MIAT-WT)、突變型載體(MIAT-MUT)以及NPAS4野生型載體(NPAS4-WT)、突變型載體(NPAS4-MUT)分別與miR-NC、miR-203共轉染至對數期生長的HGC-27細胞中，6 h后收集細胞，采用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性，以兩者比值作為目的基因熒光素酶活性。

2.7 Western blot法檢測細胞中MMP-3、MMP-9、CyclinD1、NPAS4蛋白表達

收集各組HGC-27細胞提取總蛋白，BCA法定量，取適量蛋白樣品進行電泳、轉膜，于5%脫脂奶粉中封閉2 h，加入MMP-3、MMP-9、CyclinD1、NPAS4一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗，37 ℃孵育2 h，DAB顯色，凝膠成像系統分析條帶灰度值，以GAPDH為內參蛋白，計算目的蛋白的相對表達量。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 lncRNA MIAT、miR-203、NAPS4在正常胃黏膜上皮細胞和胃癌細胞中的表達

qRT-PCR結果顯示，與正常胃黏膜上皮細胞GES-1比較，胃癌細胞HGC-27中lncRNA MIAT表達顯著升高(P<0.05)，miR-203表達顯著降低(P<0.05)，NAPS4 mRNA表達顯著上調(P<0.05),見表1。

表1 lncRNA MIAT、miR-203、NAPS4在正常胃黏膜上皮細胞和胃癌細胞中的表達

3.2 沉默lncRNA MIAT對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

Western blot法與Transwell實驗檢測發現，與對照組比較，si-NC組HGC-27細胞活力與侵襲、遷移能力以及MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達均無顯著差異(P>0.05)；與si-NC組比較，si-MIAT組lncRNA MIAT表達顯著降低(P<0.05)，提示沉默lncRNA MIAT表達的HGC-27細胞構建成功，HGC-27細胞活力顯著降低(P<0.05)，細胞遷移與侵襲能力下降(P<0.05)，MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。結果見圖1、2和表2、3。

圖1 各組HGC-27細胞侵襲與遷移情況(×400)

表2 各組HGC-27細胞lncRNA MIAT表達以及細胞活力、侵襲與遷移個數的比較

圖2 各組HGC-27細胞中MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達

表3 各組HGC-27細胞中MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達的比較

3.3 lncRNA MIAT靶向調控miR-203的表達

生物信息學網站StarBase(https://starbase.sysu.edu.cn/)預測可知，lncRNA MIAT與miR-203之間均存在連續的互補結合位點，見圖3。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，MIAT-WT和miR-203共轉染與MIAT-WT和miR-NC共轉染比較，熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；MIAT-MUT和miR-203共轉染與MIAT-MUT和miR-NC共轉染比較，熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05)，結果見表4。qRT-PCR結果顯示，si-MIAT組(1.75±0.17)HGC-27細胞中miR-203表達顯著高于si-NC組(0.95±0.07)(P<0.05)。

圖3 lncRNA MIAT與miR-203的靶向結合位點

表4 雙熒光素酶報告基因實驗結果

3.4 lncRNA MIAT靶向miR-203調控NPAS4的表達

生物信息學網站TargetScan(https://www.targetscan.org/vert_71/)預測可知，NPAS4與miR-203之間存在連續的互補結合位點，見圖4。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，NPAS4-WT和miR-203共轉染與NPAS4-WT和miR-NC共轉染比較，熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，NPAS4-MUT和miR-203共轉染與NPAS4-MUT和miR-NC共轉染比較，熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05)，結果見表5。qRT-PCR與Western blot檢測結果顯示，miR-203組HGC-27細胞中NPAS4 mRNA及蛋白表達顯著低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-203組HGC-27細胞中NPAS4 mRNA及蛋白表達顯著高于anti-miR-NC組(P<0.05)，另外si-MIAT組HGC-27細胞中NPAS4 mRNA及蛋白表達顯著低于si-NC組(P<0.05)，si-MIAT+anti-miR-203組HGC-27細胞中NPAS4 mRNA及蛋白表達顯著高于si-MIAT+anti-miR-NC組(P<0.05)，結果見圖5、表6。

圖4 NPAS4與miR-203的靶向結合位點

表5 雙熒光素酶報告基因實驗結果

圖5 各組HGC-27細胞中NAPS4蛋白表達

3.5 過表達miR-203或抑制miR-203表達對胃癌細胞增殖、遷移與侵襲的影響

Western blot法與Transwell實驗檢測發現，與miR-NC組比較，miR-203組miR-203表達顯著升高(P<0.05)，細胞活力以及遷移與侵襲能力下降(P<0.05)，MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達均顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-NC組miR-203表達顯著降低(P<0.05)，細胞活力以及細胞遷移與侵襲能力顯著升高(P<0.05)，MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達均顯著上調(P<0.05)；此外，與si-MIAT+anti-miR-NC組比較，si-MIAT+anti-miR-203組miR-203表達顯著降低(P<0.05)，細胞活力以及細胞遷移與侵襲能力顯著升高(P<0.05)，MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達均顯著上調(P<0.05)。結果見圖6、7和表7、8。

表6 各組HGC-27細胞中NAPS4 mRNA、蛋白表達的比較

圖6 各組HGC-27細胞侵襲與遷移情況(×400)

表7 各組HGC-27細胞中miR-203表達與細胞活力、侵襲與遷移個數的比較

圖7 各組HGC-27細胞中MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達

3.6 過表達NAPS4對胃癌細胞增殖、遷移與侵襲的影響

Western blot法與Transwell實驗檢測發現，與pc-NC組比較，pc-NAPS4組NAPS4 mRNA和蛋白表達均顯著上調(P<0.05)，與細胞活力以及細胞遷移與侵襲能力顯著升高(P<0.05)，MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達均顯著上調(P<0.05)；此外，與pc-NAPS4+miR-NC組比較pc-NAPS4+miR-203組NAPS4 mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，細胞活力以及細胞遷移與侵襲能力顯著降低(P<0.05)，MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達均顯著下調(P<0.05)。結果見圖8、9和表9、10。

表8 各組HGC-27細胞中MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達的比較

圖8 各組HGC-27細胞侵襲與遷移情況(×400)

表9 各組HGC-27細胞中NAPS4 mRNA表達與細胞活力、侵襲與遷移個數的比較

圖9 各組HGC-27細胞中MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達

表10 各組HGC-27細胞中MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達的比較

4 討論

胃癌是我國多發的一種常見消化系統惡性腫瘤，死亡率占全國癌癥相關死亡第二名[15]。目前胃癌的根治方法主要是徹底清除原發腫瘤以及轉移浸潤的癌旁組織，并減少復發，提高預后生存率，但由于胃癌發展過程涉及多種因素和機制，對于其診斷、治療、預后都帶來了極大的挑戰[16]。lncRNAs在腫瘤中異常表達，參與腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲與凋亡等惡性行為過程，可用作腫瘤治療的新型靶點[17-18]。對于lncRNA MIAT在胃癌中的表達與作用，已有學者研究報道[19-20]。本研究結果顯示，lncRNA MIAT在胃癌細胞中高表達，沉默lncRNA MIAT可顯著降低HGC-27細胞活力與侵襲、遷移能力，下調MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達。

前期我們采用miRNA芯片技術(Exipon mercury LNA microRNA 16.0)篩選胃癌組織中表達異常的miRNA，本研究結果顯示，miR-203在胃癌細胞中表達顯著下調，抑制miR-203的表達可促進胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲等過程，而過表達miR-203可顯著抑制以上細胞行為，此結果與前人研究結果一致[21]。但miR-203在胃癌中的調控機制尚未闡明，我們采用TargetScan等生物信息學數據庫預測其靶基因，并通過雙熒光素酶報告基因實驗檢測發現，miR-203與lncRNA MIAT和NAPS4均具有靶向關系，且抑制miR-203表達可顯著逆轉沉默lncRNA MIAT對NAPS4表達、細胞活力以及遷移與侵襲能力的抑制作用，表明lncRNA MIAT可通過靶向miR-203調控NAPS4表達，在胃癌中發揮促癌作用。

NAPS4是存在于神經系統中的一種轉錄因子，與學習行為建立和記憶形成存在密切聯系，但也有研究證明，其作用并未局限于神經系統，在胰島β細胞毒性中也可發揮作用[22]。本研究結果顯示，胃癌細胞中NAPS4呈高表達，與lncRNA MIAT表達趨勢一致；過表達NAPS4可促進胃癌細胞增殖、遷移與侵襲，同時上調MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達；且miR-203過表達可顯著削弱NAPS4過表達對胃癌細胞惡性行為學的促進作用?；谝陨涎芯拷Y果，表明lncRNA MIAT可通過miR-203調控NAPS4促進胃癌細胞增殖、侵襲、遷移。

綜上所述，lncRNA MIAT可通過靶向miR-203調控NAPS4，促進胃癌細胞增殖、遷移與侵襲，這為胃癌診斷提供了新靶點，為胃癌治療與預后提供了新的思路。但由于胃癌發生涉及基因表達多樣，lncRNA MIAT作用機制復雜，關于lncRNA MIAT參與胃癌發生的機制還需深入探索。