葛根芩連湯治療結直腸癌的潛在靶點及作用機制研究

蔡蓉，周燕萍，張金金，胡作為，2

【提要】目的 采用網絡藥理學方法探討葛根芩連湯治療結直腸癌(CRC)的靶點和機制，通過生物信息學分析，驗證CRC與鄰近正常組織之間潛在靶基因的表達及預后關系。方法 利用TCMSP預測葛根芩連湯的化學成分及相關作用靶點，結合GeneCards,OMIM以及CTD數據庫篩選與CRC疾病的共同靶點，通過Cytoscape軟件構建藥物-活性成分-疾病-靶點互作網絡，并采用R軟件進行GO富集和KEGG通路分析。最后，分別通過TCGA數據庫和ROC、模型構建和評估的臨床統計等驗證了靶基因的差異表達和預后分析。結果 共收集葛根芩連湯與CRC的共同靶點153個，其中核心化合物有黃芩素、槲皮素、半枝蓮素、豆甾醇等，MMP3、ALB、AKT1、VEGFA、IL1B等可作用葛根芩連湯抗結直腸癌的核心靶點。GO富集分析共得到430條結果，主要富集在G蛋白偶聯神經遞質受體活性，神經遞質受體的活動，G蛋白偶聯受體信號通路，偶聯環核苷酸第二信使等。KEGG通路分析共得到72條通路，涉及Toll樣受體信號通路，鈣信號通路多條經典的炎癥及腫瘤調節通路等。通過ROC分析探索hub genes，以及預后分析，發現MMP3在TNM 分期和風險預后模型都具有統計學意義。結論 結直腸癌中MMP3、ALB、AKT1、VEGFA、IL1B等差異表達是葛根芩連湯治療CRC的潛在治療靶點，通過影響Toll樣受體信號通路，鈣信號通路等多條信號傳導發揮治療結直腸癌的作用，體現了中藥多成分-多靶點-多途徑的作用特點。

結直腸癌(CRC)是全球三大癌癥之一，其致死率在世界上排名第三[1]，而且有研究表明，近年來CRC發病率逐年遞增，甚至越來越年輕化[2]?，F有的治療方案主要包括放、化療和腫瘤病變部位的手術切除，但是放、化療會產生嚴重的毒副作用，手術治療也會有一些并發癥，效果不甚理想，同時患者的依從性和生活質量大幅度下降，導致治療中途被迫停止或療效欠佳[3]。因此迫切需要尋找新的治療策略及方案，而中藥及其有效成分對CRC患者在改善癥狀、延長生存期限、調節免疫功能和提高生活質量等方面具有獨特及不可取代的優勢[4]。

葛根芩連湯源自《傷寒論》，由葛根、黃芩、黃連、甘草4味藥材組成，是醫圣張仲景治療表證未解，邪熱入里證的經典方劑。目前研究發現，該復方化學成分復雜，王婷婷等[5]應用UPLC-LTQ-Orbitrap高分辨質譜儀從葛根芩連湯中鑒定出67個化合物，現代藥理學研究表明葛根芩連湯及其藥效物質在抑制炎癥[6]、抗菌[7]、抗氧化[8]、保護腸道黏膜[9-10]等方面均有良好作用。然而，盡管已知葛根芩連湯的治療效果，但其藥理和分子作用機制尚未完全闡明。網絡藥理學為探索中國傳統配方的兼容性和機制提供了有力的工具。

本研究采用網絡藥理學方法預測了葛根芩連湯治療CRC的靶點和機制。通過生物信息學分析，驗證了CRC與鄰近正常組織之間潛在靶基因的表達，并驗證了CRC中潛在靶基因與預后的關系。

1 材料與方法

1.1 數據庫與軟件

包括中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP) (http://tcmspw.com/tcmsp.php) ；靶點預測平臺GeneCards(http://www.genecards.org/),OMIM(http://www.omim.org/)以及CTD數據庫(http://ctdbase.org/)；網絡拓撲屬性分析軟件 Cytoscape 3.7.2；蛋白質相互作用分析平臺String(https://string-db.org/) ；癌癥基因組圖譜TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)；統計分析軟件R(3.6.3版本)；pROC包[1.17.0.1版本]；RMS 包(版本：5.1-4；https://cran.r-project.org/web/packages/rms/index.html)

1.2 葛根芩連湯的活性成分、作用靶點及結直腸癌疾病靶點的收集

應用TCMSP檢索葛根芩連湯全方中葛根、黃芩、黃連、炙甘草的所有活性成分。根據研究結果，以口服生物利用度(OB) ≥30%，類藥性(DL)≥0.18 為限制條件進行篩選，得到葛根芩連湯的生物活性成分，利用該平臺得到相關有效成分的作用靶點。設置檢索詞為“colorectal cancer”，應用GeneCards,OMIM以及CTD數據庫進行檢索，經匯總、并集、去重后得到結直腸癌的疾病靶點。將藥物靶點與疾病靶點取并集獲得藥物與疾病的共同靶點。

1.3 藥物-活性成分-疾病-靶點互作網絡構建

應用 Cytoscape軟件構建藥物-活性成分-疾病-靶點互作網絡。網絡圖中“node”代表藥物、活性成分、疾病和靶點，“edge”代表以上節點之間的相互關系。應用STRING和Cytoscape平臺中的CytoHubba插件構建共同靶點PPI，并刪去網絡中游離的節點?！肮濣c(node)”代表不同靶點，“邊(edge) ”代表不同靶點之間的相互關系。

1.4 基因本體(Gene Ontology,GO) 分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG) 通路富集分析

采用R軟件“clusterProfiler”分別進行GO富集和KEGG通路分析，并將所得結果按數值P降序排列并繪制GO及KEGG條狀圖，并根據富集因子值將核心通路以通路圖形式呈現，設定P-adjust≤0.05作為篩選條件繪制靶點通路富集分析網絡。

1.5 Hub genes在結直腸癌/癌旁表達分析

從TCGA官方網站下載OADREAD(結直腸癌) level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq數據(包括51個正常組織和647個腫瘤組織)，并進一步標準化為TPM值。由于所有數據均從TCGA下載，本研究不需要倫理委員會批準。采用R軟件ggplot2包用于統計分析與可視化，用結直腸癌組織和正常結直腸組織作為變量生成散點圖以計算hub基因的差異表達。

1.6 hub genes預后、模型構建和評估的臨床統計分析

通過ROC分析探索hub基因的診斷價值，評估hub基因和生存率之間的相關性。所有統計分析通過pROC軟件包實現的(Robin et al，2011)。計算出的曲線下面積(AUC)值范圍為0.5～1.0，表明識別能力為50%～100%。使用Cox回歸分析用于比較hub基因表達對TCGA患者的總生存期(OS)的影響以及分期的影響，構建森林圖?；贑ox回歸模型，選擇在臨床變量中的cox回歸分析中P<0.05者進行分析，獲得的多因素Cox中P值有意義的變量作為獨立預后因素用于建立列線圖，對 1 年、3 年和 5 年的預測生存概率進行個體化。RMS 包用于生成列線圖，其中包括重要的臨床特征和校準圖。Calibration進行預后模型校準度分析，最后使timeROC包進行時間依賴性ROC曲線看hub基因在1、3、5年在結直腸癌進展和預后中的作用,其中預后數據來自一篇Cell的文章[11]。

2 結果

2.1 葛根芩連湯的活性成分及結直腸癌疾病靶點篩選

通過TCMSP數據庫對葛根芩連湯中4味中藥已報道活性成分進行檢索，并以OB≥30%和 DL≥0.18為限制條件對其活性成分進行初步篩選，得到結果為葛根4個、黃芩36個、黃連14個、甘草92個，共收集到146個活性成分，去重后共得到140個生物活性成分(表1)，并利用該平臺得到相關有效成分的作用靶點，并通過Uniprot數據庫將中藥靶點進行基因注釋。

表1 葛根芩連湯中候選的活性成分信息

續表1

續表1

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通過檢索GeneCards、OMIM、CTD數據庫得到結直腸癌的疾病靶點，經過去重共得到1025個疾病治療靶點。 應用R語言軟件取并集獲得藥物與疾病的共同靶點153個，見圖1A。

圖1 互作網絡圖 A：葛根芩連湯作用靶點與疾病共同靶點韋恩圖；B：葛根芩連湯-有效活性成分-疾病共同靶點互作網絡，藍色三角形為有效活性成分，橙色橢圓形為疾病共同靶點

2.2 藥物的活性成分-靶點互作網絡構建

應用 cytoscape構建藥物活性成分-靶點互作網絡(圖1B)，選取具有多個靶點且Degree最高的TOP 10的化合物節點(對應的Degree值分別為52、50、48、45、40、37、22、22、14、10)，作用靶點為84個，由圖體現了葛根芩連湯治療結直腸癌的多靶點、多成分的特點。

應用STRING平臺構建共同靶點PPI(圖2A)，并刪去網絡中游離的節點?！肮濣c(node) ”代表不同靶點，“邊(edge) ”代表不同靶點之間的相互關系，并進行Cytoscape美化，再利用插件CytoHubba插件選top20基因(圖2B，表2，表3)可見蛋白互作頻次較高的有ABCG2、MMP3、ALB 、CYP2C19 、CYP2D6、SCL22A8等，以上可作為葛根芩連湯治療結直腸癌的潛在靶點。

圖2 蛋白互作網絡 A:STRING;B:Cytoscape美化圖; C:Cytoscape+Cytohubba插件選top20基因

表2 Cytohubba算法計算結果

表3 關鍵靶點的拓撲參數分析

2.3 GO分析和KEGG通路富集分析

使用R軟件“cluster-profiler”對以上84個靶標進行GO富集和KEGG通路分析。關鍵靶點的GO富集分析結果按照P由低到高排序,選取顯著性排名前10的結果(圖3，表4)，分析結果顯示葛根芩連湯具有微管結合，組蛋白激酶活性，微管蛋白結合，趨化因子的活動等分子功能，參與有絲分裂核分裂，核分裂，細胞器裂變，有絲分裂姐妹染色單體分離等生物過程，細胞組分有主軸，有絲分裂紡錘體，紡錘體微管，濃縮的染色體，著絲點區域，染色體著絲粒區域等來參與蛋白的合成，可見葛根芩連湯通過調控多個復雜的生物功能來治療結直腸癌。KEGG 通路富集分析結果以氣泡圖形式呈現(圖3，表4)，可見葛根芩連湯的作用通路主要集中于細胞周期，卵母細胞減數分裂，細胞衰老，病毒蛋白與細胞因子及細胞因子受體的相互作用，PPAR信號通路等。以探究葛根芩連湯治療結直腸癌可能的作用機制。并繪制了單體-靶點-通路圖(見圖4)。

表4 GO，KEGG分析表

續表4

圖4 單體-靶點-通路圖 藍色三角形為有效活性成分，橙色橢圓形為靶點，黃色矩形為通路

表5 644例結直腸癌患者臨床資料信息表 [n (%)]

圖5 hub genes在結直腸癌/癌旁表達分析 ns: P≥0.05; *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001

2.4 hub genes在結直腸癌/癌旁表達分析

根據結果，在結直腸癌中，與對照相比可以看出IL1B (B)、AKT1 (C)、CXCL8 (D)、MMP9 (E)、CTNNB1 (F)、TLR2 (H)、MPO (I)、CXCL10 (J)、MMP1 (K)、MMP3 (L)、SPP1 (N)、CD40LG (O)、PLAU (Q)、ABCG2(R)及SNAI2(T)均有統計學意義 (P<0.05)。

2.5 hub genes在結直腸癌的ROC分析

根據圖6結果，在直腸癌中，與正常對照組相比，可以看出IL1B (A)，CXCL8 (C)，MMP9 (D)，CTNNB1 (E)，CXCL10 (H)，MMP1 (I)，MMP3 (J)，SPP1 (K)，CD40LG (L)，PLAU (M)，ABCG2 (N) 在AUC值均大于0.7，表現出較高的診斷價值。

圖6 hub genes在結直腸癌的ROC分析

2.6 hub genes在結直腸癌的預后分析

根據結果可以看出，在結直腸癌疾病中，與對照組相比，MMP3(G)表達與預后相關(P<0.01)，而IL1B (A)，CXCL8 (B)，MMP9 (C)，CTNNB1 (D)，CXCL10 (E)，MMP1 (F)，SPP1 (H)，CD40LG (I)，PLAU (J)，ABCG2 (K)其他 10 個基因表達與預后無關(P>0.01)。因此，只有MMP3進入了模型構建的后續階段。

2.7 hub genes在結直腸癌的森林圖分析，Nomogram分析，Calibration分析，time-ROC分析

在 TCGA-結直腸癌集合中構建和驗證預測列線圖。對TCGA結直腸癌數據集中數據的單變量和多變量Cox回歸分析驗證了MMP3基因特征的顯著性，其中發現其在TNM 分期和風險預后模型都具有統計學意義(圖8)。此外，基于這些結果，我們開發了預測模型，并生成了列線圖，分別預測 OS 和1、3、5 年生存率的概率。在hub genes在結直腸癌的time-ROC分析中我們發現1、3和5年的AUC分別達到0.766(95%CI0.689～0.842)、0.769(95%CI0.699～0.838)和0.721(95%CI0.631～0.812)MMP3在結直腸癌進展和預后中起著至關重要的作用?？傊?，結合預后和TNM分期模型為結直腸癌患者的總生存期提供了良好的預測潛力。

圖7 hub genes在結直腸癌的預后分析

圖8 hub genes在結直腸癌的森林圖分析，Nomogram分析，Calibration進行預后模型校準度分析 A：單變量Cox回歸分析的森林圖，P<0.05的值被認為是顯著的；B：列線圖是基于MMP3預測預后因素建立的；C：分別用于1年、3年和5年生存率的列線圖內部驗證的校準圖；D：MMP3在結直腸癌的time-ROC分析，列線圖的時間依賴性ROC曲線分別比較1年、3年和5年總生存率

3 討論

中醫理論認為腫瘤的發生多為濕熱毒聚，熱久成瘤的結果，濕熱伏邪為起病的關鍵，痰濁內阻耗陰損陽加重正虛，為腫瘤病情進展的主要環節[12]。周岱翰、郁仁存等當代國醫大師對腫瘤的論治經驗，熱毒是腫瘤的重要病理因素之一，清熱解毒法必須貫穿整個癌癥治療過程，而CRC的病性為本虛標實，即全身為虛，局部屬實，且熱毒內蘊為實[13]。

但中藥配方總是含有不同種類的草藥，并對多種靶點有影響，因此中藥配方的抗腫瘤機制難以了解。網絡藥理學，最初由Hopkins[14-15]提出，結合系統生物學、生物信息學和多藥理學是研究中藥配方[16]中成分活性和靶點的有效途徑。生物信息學分析是一種強大的方法，可以幫助識別腫瘤發生、進展和治療的重要機制。綜合網絡藥理學和生物信息學分析可以幫助我們探索中國傳統癌癥配方的機制。

通過TCMSP數據庫對葛根芩連湯中活性成分進行檢索，發現黃芩素、半枝蓮素、槲皮素、豆甾醇等活性成分中與結直腸癌的共同靶點較多。研究表明，黃芩素可以介導PI3K/Akt/mTOR, NFκB, MAPK/ERK, Wnt/β-catenin等癌癥關鍵信號通路的調控[17]。槲皮素可下調IL-6/STAT3信號通路的活性,減少炎性因子水平,阻礙腫瘤細胞的增殖,促進腫瘤細胞的凋亡,從而保護結腸炎性相關結腸癌小鼠組織損傷[18]。

本研究結合葛根芩連湯治療CRC的潛在靶點以及 KEGG通路富集到的相關基因，發現可能主要通過基質金屬蛋白酶3(MMP3)、血清白蛋白(ALB)、蛋白激酶B1(AKT1)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、白介素1B(IL1B)等多個靶點共同作用，從而達到抗腫瘤的效果。通過KEGG 通路富集分析，發現葛根芩連湯可以主要通過細胞周期、卵母細胞減數分裂、細胞衰老、病毒蛋白與細胞因子及細胞因子受體的相互作用、PPAR信號轉導通路等發揮抗腫瘤作用。再經過臨床預后分析等結果顯示，則可將MMP3作為本次研究中的核心基因，為后續具體的葛根芩連湯抗腫瘤機制研究提供參考。

而MMP3屬于基質金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases, MMPs)的重要成員，是細胞外基質(ECM)合成和調節降解代謝平衡過程中存在的關鍵性酶之一，它能激活MMP2和MMP9，通過調節釋放TGFβ1，影響腫瘤細胞的侵襲和轉移、增殖等，以此在腫瘤進展及轉移中起到重要作用[19-21]。蔣炳林等證明，結腸在直腸癌中MMP3、MMP7、MMP9、MMP13和MT1-MMP高表達，且MMP3的表達量是與結直腸癌的進展密切相關的,并隨著結直腸癌的惡化,MMP3的表達量上升[22]。丁志祥[23]等利用生物信息學方法挖掘結腸癌的樞紐基因及潛在標志物，經驗證發現CCND1、COL1A1、COL1A2、CXCL1、CXCL8、MMP1、MMP3、MYC和SPP1在結腸腺癌組織中表達顯著高于正常結腸組織,為結腸癌的分子機制研究及預后判斷提供了新靶點。而且已經有研究證明，一些中藥組分在結直腸癌中可通過不同機制下調MMP1和MMP3的表達從而抑制腫瘤細胞增殖和侵襲[24-25]。

本研究結果表明，與癌旁組織相比，MMP3的表達在CRC中明顯升高。來源于TCGA的數據也表明，對TCGA結直腸癌數據集中數據的單變量和多變量Cox回歸分析驗證了MMP3基因特征的顯著性，其中發現其在TNM分期和風險預后模型都具有統計學意義,可能促進CRC的惡性進展和轉移。因此，MMP3有望成為CRC治療的潛在靶標。