NMI通過NF-κB信號通路促進急性胰腺炎炎癥反應

吳浪,陳升鑫,張貫軍,張大涯,陳德鑫,李明陽

【提要】目的 急性胰腺炎是消化系統常見的急腹癥，患病率高，治療方法有限，發病機制復雜。本研究的目的是確定急性胰腺炎發病中可靠的差異表達基因和潛在的致病機制，豐富急性胰腺炎的研究，為未來在治療上提供更多的參考價值和依據。方法 從GEO數據庫獲得高通量數據集GSE194331和GSE109227的全基因組表達譜，找出表達值高且存在共表達的差異表達基因，再對這些基因蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建，篩選出存在關聯的50個基因，進一步對這些基因進行基因本體和KEGG通路富集分析。接下來，從中挑出一個目標基因NMI進行實驗驗證。首先，收取急性胰腺炎患者的血液樣本驗證NMI的激活。然后，用雨蛙素對野生小鼠造急性胰腺炎模型驗證NMI的活化。最后，通過NMI基因敲除小鼠驗證NF-κB信號通路。結果 從數據集中篩查出246個共表達的差異基因，其中50個基因在蛋白互作網中存在著關聯性，基因富集分析表明這些基因主要參與了NF-κB、TLR和MAP多條信號傳導通路。實驗也驗證了從中挑選出的NMI基因在急性胰腺炎患者和野生鼠的胰腺炎模型中激活，并且NMI基因敲除后，小鼠胰腺組織的NF-κB/p65的基礎表達水平明顯降低，磷酸化NF-κB/p65在NMI KO胰腺炎組小鼠中活化水平明顯低于野生胰腺炎組。NMI KO胰腺炎組中胰腺腺泡的損傷程度比野生胰腺炎組低。結論 NMI可通過NF-κB信號通路促進急性胰腺炎的損傷過程。

急性胰腺炎是消化系統一種常見得到急腹癥，它是胰酶激活引起自身組織消化而導致的內源化學性炎癥反應。膽結石和高脂血癥是急性胰腺炎的兩大病因，酗酒和暴飲暴食被公認為最常見的誘因[1-3]。盡管大多數急性胰腺炎表現為輕癥，但病情進展時可累及全身臟器衰竭，發展為重癥急性胰腺炎，死亡率可高達50%以上，占胰腺炎總死亡率的2%～5%[4]，在臨床上主要以對癥支持治療為主，尚無特效藥物控制病情。雖然有不少關于急性胰腺炎藥物及治療方面的研究，Parabacteroides[5]、Isoliquiritigenin[6]、Wedelolactone[7]和西格列汀[8]等均能減輕急性胰腺炎的炎癥反應，但其臨床療效并未得到驗證。

大量的科研成果證實了急性胰腺炎的發病機制與基因的多態性有關，如PRSS1[9]，DPPIV[10]，TPH1[11]等。并且研究表明多條信號通路參與了急性胰腺炎的發病過程，p62-Keap1-Nrf2[8],JAK2/STAT3[12],JNK[13],NF-κB[14]和p38/MAPK[15]等通過不同的作用機制發揮著不可替代的作用。最新證據揭示鐵死亡和細胞焦亡也參與了急性胰腺炎的致病機制[7, 16]。然而，大部分研究是在動物誘導模型的背景下模擬進行的，如雨蛙素[9]、脂多糖[17]、?；鞘懰崃蛩猁}[18]等誘導小鼠急性胰腺炎模型，其機制研究到底有多少是與人類急性胰腺炎的發病機制是一致的，我們不得而知。

在本研究中，我們應用生物信息學的方法，以基于來自公共數據庫的高通量測序結果，綜合分析了人類和小鼠急性胰腺炎模型的全基因組測序的共同差異基因表達和信號通路分析，并篩選其中一個基因進行實驗驗證，闡明相關基因在急性胰腺炎中的致病機制，希望未來為靶向藥物的研究提供新的證據。

1 材料和方法

1.1 數據采集和處理

GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是一個注釋非常豐富的綜合數據庫，我們從GEO數據庫篩選出GSE194331和GSE109227數據集。數據集GSE194331基于平臺GPL16791(Illumina HiSeq 2500),包括32名健康對照組，57名輕癥急性胰腺炎，20名中重癥急性胰腺炎，10名重癥急性胰腺炎患者。從中獲得了急性胰腺炎外周血的RNA-Seq數據，包括矩陣文件數據和補充文件數據。然后根據樣本編號、疾病編號和基因表達情況逐一進行核對，以確保個體中的基因表達譜對應正確的患者。在這項研究中，我們選擇了輕癥急性胰腺炎的樣本數據。數據集GSE109227基于平臺GPL6246(Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST Array)，包括5只注射氯化鈉的野生型小鼠作為對照，5只腹腔注射雨蛙素誘導急性胰腺炎的小鼠胰腺作為實驗組。

1.2 數據處理及差異基因的識別

數據集GSE194331和GSE109227的原始數據從GEO數據庫下載，GSE194331通過R包進行處理,先對數據集進行基因名轉換，并去掉缺失值，選出平均值大于100的基因。GSE109227數據集通過GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?acc=GSE109227)進一步處理。兩個數據集均進行質量歸一化，|log2倍數變化 (log2FC)|>log21.5和P<0.05被設置為篩選差異表達基因的標準。用R包繪制韋恩圖。

1.3 差異基因的蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建

STRING[19]在線工具(https://cn.string-db.org/)是用于檢索相互作用基因的搜索工具，它可以用來探索差異基因編碼蛋白質之間的相互關系以及差異基因的蛋白質-蛋白質相互作用網絡，綜合得分>0.7且節點之間存在著關聯被認為是有意義的，并被映射到網絡中。接下來，用Cytoscape軟件構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡，并對存在著關聯的基因用R包繪制熱圖。

1.4 功能富集分析

DAVID[20]數據庫 (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)是一個集注釋、可視化和集成在線工具，它為科研人員提供了全面的注釋信息以了解基因的背后的生物學意義。在該研究中，我們引入了DAVID數據庫對已識別基因的功能注釋和通路分析，選擇P值<0.05且FDR<0.05作為富集項閾值，獲取了基因本體和京都基因與基因組百科全書通路中的差異基因富集結果。用R包作圖可視化分析。

1.5 試劑和材料

酶聯免疫試劑盒人源NMI、小鼠NMI和小鼠IL-18從華美(武漢，中國)獲得，酶聯免疫試劑盒小鼠IL-18和IL-1β購買于R&D system (Minneapolis, MN, 美國)，IL-雨蛙素來自于MedChemExpress (New Jersey, 美國)。NF-κB p65抗體從Abcam(Cambridge, MA, 美國)購置，anti-rabbit-IgG和anti-mouse IgG從Cell Signaling (Beverly, MA, 美國)購買，GAPDH 抗體來自于TRANS (北京,中國)。

1.6 人血液樣本實驗驗證

輕癥急性胰腺炎患者(32名)的血液樣本從解放軍總醫院第一醫學中心就診的患者中采集，健康志愿者(16名)的血液樣本作為對照。靜置、4 ℃ 3 000 rpm 離心5分鐘，分離血漿并儲存于-80 ℃，用Elisa法檢測NMI、IL-1β和IL-18水平。知情同意書經中國人民解放軍總醫院醫學倫理委員會批準，S2021-612-03).

1.7 野生型小鼠實驗驗證

從SPF (Beijing) 生物技術有限公司購買C57BL/6種系野生小鼠，體重18～25 g，雌雄不分，所有小鼠均喂食標準嚙齒動物飼料和清水，動物實驗申請獲得了中國人民解放軍總醫院動物倫理委員會批準(SQ2021299)，所有小鼠均在麻醉狀態下脫頸處死。用雙蒸水稀釋雨蛙素(濃度：10 μg/mL，pH約7.0)。將小鼠隨機分為2組，每組6只：對照組(不處理)，急性胰腺炎組(雨蛙素50 μg/kg/h，腹腔注射，6次)。在第7小時，麻醉狀態下進行眼球取血，并置于涂有EDTA的EP管，將血液樣本在4 ℃ 3 000 rpm 的條件下離心5分鐘，取血漿進行淀粉酶、脂肪酶、NMI和炎癥因子水平檢測.

1.8 NMI基因敲除小鼠驗證NF-κB信號通路

以C57BL/6種系野生小鼠為背景，進行NMI基因整體敲除，對雌性C57BL/6超排卵后與雄性C57BL/6小鼠交配并收集輸卵管中的受精卵。將Cas9 mRNA (150 ng mL-1) 和轉錄的sgRNA (100 ng mL-1) 混合并在M2培養基 (Sigma，M7167, 100 mL) 中顯微注射到具有狀態良好的核仁的受精卵的細胞質中。將小鼠分為4組，體重18～25 g，雌雄不分，每組6只：野生對照組(不處理)，NMI KO對照組(不處理)，野生急性胰腺炎組(雨蛙素50 μg/kg/h，腹腔注射，6次)，NMI KO急性胰腺炎組(雨蛙素50 μg/kg/h，腹腔注射，6次)。在第7小時，進行眼球取血，并置于涂有EDTA的EP管，將血液樣本在4 ℃ 3 000 rpm 的條件下離心5分鐘，取血漿進行淀粉酶、脂肪酶和炎癥因子水平檢測。取每只小鼠胰腺組織，分兩份，一份置于-80℃用于提取蛋白，一份固定于多聚甲醛用于蠟片包埋。

1.9 組織蛋白質印跡

為了評估組織中的特定蛋白質活性，我們研磨了小鼠胰腺組織，并使用NP40提取了總蛋白質。在蛋白質定容定量和變性后，用十二烷基硫酸鈉 - 聚芳酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行電泳并轉移到膜上，用脫脂牛奶封閉1 h后，檢測GAPDH和NF-κB/P65的特異性抗體。

1.10 組織病理學分析

將胰腺組織固定在4%多聚甲醛(PFA)中，包埋在石蠟中，切成5 μm片，然后用蘇木精和伊紅(HE)染色(北京瑞博科技有限公司)。在×200放大倍率的光學顯微鏡下觀察組織的病理改變。

2 結果

2.1 差異基因的識別

從GSE194331數據集下載了119個樣本急性胰腺炎患者的RNA-Seq信息，其中輕度急性胰腺炎患者57名。對所有樣本的基因表達值用R包進行分析。用EdgeR統計方法分析差異表達基因。我們使用GEO2R工具處理GSE109227數據集并進行歸一化后，篩選出了3080個基因上調，2457個基因下調。圖1A為數據集GSE194331和GSE109227的差異表達基因的韋恩圖。其中有246個為在兩個數據集中共表達的基因。接下來，使用STRING在線工具(https://cn.string-db.org/)和Cytoscape軟件，將246個有差異的共表達轉錄因子過濾到PPI網絡中，組合得分大于0.7，并且在Cytoscape中存在著關聯的基因包含50個節點，69條邊(圖1B)。一個節點代表網絡中的一個基因，邊代表基因之間的相互作用。 圖1C為該50個基因在數據集GSE194331的輕癥急性胰腺炎血液樣本中的表達熱圖。

圖1 從GSE194331和GSE109227高通量數據集中鑒定差異表達基因 A： GSE194331數據集急性胰腺炎血清樣本高通量測序中差異表達基因的火山圖；B：GSE109227數據集小鼠急性胰腺炎模型胰腺組織高通量測序中差異表達基因的火山圖。藍色圖表示高表達水平的基因，紅色圖表示低水平表達的基因，灰色表示沒有差異表達的基因；C： GSE194331和GSE109227數據集與轉錄因子重疊的基因的韋恩圖；D：GSE194331和GSE109227數據集與轉錄因子重疊的共同的差異表達基因的韋恩圖

2.2 通路富集分析

為了研究我們篩選出來的差異表達基因的功能注釋，我們通過DAVID數據庫對共表達的50個差異轉錄因子進行了功能富集分析。圖2A顯示了三類GO術語生物過程的氣泡圖，氣泡的顏色表現P值，大小表示與差異基因的計數成正比。生物過程中富含差異表達基因的GO術語主要為炎癥反應。圖2B顯示KEGG通路富集分析表明這些差異表達基因參與了多條信號傳導通路，包括NF-κB、TLR和MAPK。

圖2 差異表達基因的功能及通路富集分析 A：生物過程；B：KEGG通路。點的大小代表富集的差異基因數量,顏色代表P值

2.2.1 基因NMI的急性胰腺炎患者中激活 在急性胰腺炎患者的血漿樣本中，NMI的水平顯著高于正常對照組(圖3A)，并且炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放明顯增多(圖3B)。這表明NMI在急性胰腺炎患者血液樣本中激活，并能促進急性胰腺炎的炎癥反應。

圖3 急性胰腺炎患者中細胞因子的活化情況 A：血漿NMI激活；B：血漿IL-18和IL-1β水平

2.2.2 基因NMI的急性胰腺炎小鼠模型中激活 雨蛙素誘導了小鼠急性胰腺炎模型，在急性胰腺炎小鼠的血漿中，淀粉酶和脂肪酶水平明顯升高(圖4A)，這表明我們的胰腺炎造模成功。并且，NMI的表達水平顯著上升(圖4B)，炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放明顯增加(圖3C)。這與我們在急性胰腺炎患者血液樣本中驗證的結果一致。

圖4 急性胰腺炎野生小鼠模型中細胞因子的釋放情況 A：血漿淀粉酶和脂肪酶水平；B：血漿NMI激活；C：血漿IL-18和IL-1β水平

2.2.3 NMI基因敲除鼠構建 NMI基因敲除小鼠構建使用CRISPR-Cas9技術制備，NMI的sgRNA序列是AAAACAAAGAACTAGACGAGG[21]。圖5為NMI-/-小鼠基因組的缺失和移碼突變的結果驗證。

圖5 使用CRISPR-Cas9技術制備NMI敲除基因小鼠，顯示了NMI-/-小鼠基因組的缺失和移碼突變

2.2.4 NMI KO小鼠驗證信號通路 NMI基因敲除降低了淀粉酶、脂肪酶和炎癥因子的基礎表達水平，但在急性胰腺炎的小鼠中，只有淀粉酶的水平明顯低于野生型小鼠(圖6A)，其余因子并未表現出明顯的統計學差異(圖6B)。同時，我們取小鼠的胰腺組織勻漿提取蛋白進行免疫印跡實驗后，發現NF-κB/p65的基礎表達水平在NMI KO小鼠明顯降低。雖然在胰腺炎的小鼠胰腺組織中，P-NF-κB/p65出現明顯的活化，但NMI KO組中，P-NF-κB p65的活化明顯不如野生小鼠組(圖6C)。從胰腺的病理組織切片，我們發現NMI KO 小鼠的胰腺組織腺泡細胞損傷程度低于野生小鼠胰腺組織(圖6D)。這表明NMI基因敲除后，雖然不影響炎癥因子的釋放，但是NF-κB/p65的表達及激活受到了抑制，NMI可能通過NF-κB信號通路參與急性胰腺炎的炎癥過程。

圖6 與野生型小鼠相比，NMI KO小鼠細胞因子和相關蛋白的表達情況 A：血漿淀粉酶和脂肪酶水平；B：血漿IL-1β和IL-18 的水平；C：免疫蛋白印跡檢測NF-κB的表達情況；D：通過H&E染色確定胰腺損傷，黑色箭頭代表腺泡細胞變性，黃色箭頭代表腺泡細胞壞死，藍色箭頭代表自噬腺泡細胞 (×200)

3 討論

在這項研究中，我們用了人和小鼠高通量測序的信息，共鑒定出246個符合篩選條件的共同差異表達基因，50個基因存在蛋白質互作關聯，對這些基因進行通路富集分析，我們發現不少基因富集在NF-κB信號通路上。在我們用實驗進行驗證其中的NMI基因和通路時，結論與我們先前的分析不謀而合。因此，我們有理由地認為NMI在急性胰腺炎中通過NF-κB通路介導炎癥反應。

NF-κB是核轉錄因子，調節這大多數基因的表達，它在細胞凋亡的調節、病毒復制、腫瘤發生、炎癥和各種免疫性疾病中起著關鍵的作用。有研究表明[22]G 蛋白偶聯受體信號傳導的調節劑和介質β-Arrestins能夠通過抑制NF-κB p65的激活來減輕急性胰腺炎，多巴胺通過抑制NF-κB通路減輕了膽囊收縮素刺激的胰腺腺泡細胞的炎癥[23]，并且血管緊張素轉換酶 (ACE)2-血管緊張素-(Ang)-(1-7)-Mas軸通過抑制p38 MAPK/NF-κB信號通路顯著抑制胰腺炎[24]，蟲草素也能通過 AMPK 抑制NF-κB和NLRP3 炎性體激活來緩解急性胰腺炎帶來的損傷[25]。朱等人[26]的研究表明p21激活激酶 1(PAK1)在急性胰腺炎小鼠模型的胰腺中上調，從而激活NF-κB和p38通路，抑制PAK1降低NF-κB和p38的活性，減輕小鼠模型胰腺的病理損傷和炎癥因子的水平。雙鏈 RNA 依賴性激酶(PKR)促進NF-κB 的激活和促炎因子的產生，它加速了急性胰腺炎中的炎癥反應和胰腺細胞損傷[27]。lncRNA母源表達基因3(MEG3)通過介導 HPDE 細胞中的 NF-κB 通路靶向 miR-195-5p/FGFR2 調節軸，參與雨蛙肽誘導的炎癥損傷[28]。

在本研究中，我們發現敲除NMI基因后，雨蛙素造模的輕癥急性胰腺炎小鼠的胰腺組織中NF-κB/p65的活化明顯受到了抑制，胰腺組織的病理損傷有所減輕，淀粉酶的釋放水平明顯減少，但血液中脂肪酶和炎癥因子的水平確沒有明顯的變化。NMI作為程序性細胞損傷應答因子，它對急性胰腺炎的致病機制是否與病情的嚴重程度有關，值得我們進一步探討。

綜上所述，NMI可通過NF-κB信號通路促進急性胰腺炎的損傷過程。