泛素蛋白酶體系統調控非酒精性脂肪性肝病研究進展

高星星，劉永剛，劉亞珠，李京濤，曾立偉，閆曙光，魏海梁，常占杰

【提要】 泛素蛋白酶體系統是一種重要的蛋白質降解系統，參與多種蛋白質相關通路的調節。多項研究發現，泛素蛋白酶體系統與非酒精性脂肪性肝病有著密切的聯系，其通過參與脂質代謝、線粒體氧化功能障礙和內質網應激障礙以及相關通路進而在非酒精性脂肪性肝病的病理進展中發揮著重要作用。本文就泛素蛋白酶體調控非酒精性脂肪性肝病進行綜述。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是我國第一大慢性肝病，最近的meta分析顯示，中國NAFLD的發病率達到了29.2%。NAFLD是一種與胰島素抵抗(insulin resistance,IR)和遺傳易感因素密切相關的代謝應激性肝損傷[1]，其病理進展包括脂肪變性、脂肪毒性和炎癥三聯反應的過程，當前研究發現，脂肪變性、氧化應激和TNF-α、IL-6等炎癥介質的存在與NAFLD中CAR、PXR、PPAR-α等核因子的改變有關[2]。全球流行病學顯示，NAFLD可進展為肝硬化(cirrhosis of liver,LC)甚至肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[3]。越來越多的實驗與臨床證據表明，泛素蛋白酶體(ubiquitin-proteasome system，UPS)及其相關通路與NAFLD密切相關，而泛素化中間絲體包涵體和Mallory體相關蛋白可作為評估NAFLD患者的可靠生物標志物[4]，且泛素也是非酒精性肝纖維化的標志[5]。本文綜述了泛素化及去泛素化的過程和功能，并總結了近年來UPS調控NAFLD治療靶點的研究現狀。

1 泛素蛋白酶體

泛素蛋白酶體是一種蛋白質降解系統，包括泛素化酶(ubiquitinating enzymes ubs)、26S蛋白酶體(26S proteasome)以及去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，dubs)[6]。近年來的研究發現，泛素蛋白酶體系統的異常直接或間接地參與了癌癥、炎癥和神經退行性疾病等疾病的發病機制[7]。

1.1 泛素化

由泛素化酶E1泛素激活酶(ubiquitin-activatingenzyme)、E2 泛素結合酶(ubiquitin-conjugatingenzymes)、E3 泛 素 連 接 酶(ubiquitin-ligaseenzymes)依次激活、結合并連接泛素C末端的甘氨酸(Gly)殘基共價結合到底物蛋白的過程稱為泛素化。泛素化過程需要ATP的參與，E1的半胱氨酸(Cys)殘基與泛素C端Gly殘基形成硫酯鍵，從而激活游離泛素分子；被激活的泛素與E2酶活性部位的Cys殘基形成硫酯鍵，并轉移到E2酶上；在E3酶的作用下，泛素的Gly殘基和底物蛋白的Lys殘基形成異肽鍵并轉移到底物蛋白上，最終形成泛素化底物。在少數情況下，靶蛋白的N端也可被泛素化[8]。根據靶蛋白修飾的作用形式不同，泛素化可分為單泛素化、多泛素化和多聚泛素化[9]。

1.2 去泛素化

蛋白質泛素化是動態翻譯后修飾(protein translational modifications,PTMs)最有效的修飾之一[10]。Dubs通過從底物中去除泛素或在泛素鏈中切割泛素從而去除泛素信號，進而調節泛素化的過程稱為去泛素化[11]。因此，泛素化是一個可逆的過程。研究發現，dubs包括7個家族：泛素特異性蛋白酶(USPs)、JAB1/MPN/Mov34金屬酶(JAMM)、卵巢腫瘤蛋白酶(OTUs)、Josephin and JAB1/MPN+(MJP)、泛素C端水解酶(UCHs)、含miu的新型DUB(MINDY)和含鋅指的泛素肽酶1(ZUP1)[7]。

2 泛素蛋白酶體系統與NAFLD

泛素蛋白酶體在蛋白酶體降解、選擇性自噬以及及細胞程序性死亡等過程中均有參與[12]。近年來，多項研究證實UPS通過參與脂質代謝、線粒體氧化功能障礙和胰島素抵抗等方面影響NAFLD的發生發展。

圖1 NAFLD發病機制示意圖

2.1 脂質代謝

2.1.1 從頭脂肪生成

從頭脂肪生成(de Novo lipogenesis，DNL)是肝臟調節脂質代謝的四種途徑之一，臨床數據表明，DNL的調節異常是NAFLD患者肝臟脂質積累的主要特征。

在肝臟脂質代謝中，DNL使肝臟能夠從乙酰輔酶A中合成新的脂肪酸。因此，DNL升高可引起肝脂肪變性，甚至可能導致脂肪性肝炎。固醇調節元件結合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP1c)是協調DNL轉錄調控的兩個關鍵轉錄因子之一，它激活肝臟中幾乎所有與甘油三酯和脂肪酸合成相關的基因。同時，SREBP1c控制FASN、ACACA等DNL途徑中關鍵合成酶的轉錄，在NAFLD的進展中發揮關鍵作用[13]。Fbw7a是SREBP1c的主要E3連接酶，相關研究表明，Smad泛素化調節因子1(smad ubiquitination regulatory factor 1,Smurf1)具有增強SREBP-1c的穩定性進而激活脂質合成的作用。同時，Smurf1在NAFLD中具有E3連接酶獨立催化活性的特點。Smurf1通過與Fbw7a競爭性地相互作用于SREBP1c的同一個區域，保護SREBP1c不被泛素化和降解，維持了SREBP1c的穩定性。此外，mTORC2還能誘導依賴fbw7a的SREBP-1c降解，并抑制癌細胞中的脂肪生成，減輕肝癌的進展[14]。

泛素特異性肽酶7(ubiquitin specific peptidase 7,USP7)是一種在以前研究中被證明具有抗癌作用的去泛素化酶。最新研究發現，USP7在DNL中亦具有重要的作用，鋅指蛋白638(zinc finger protein 638,ZNF638)是最大的轉錄因子家族的成員之一。TRAF的結構域通過介導USP7去泛素化ZNF638中的賴氨酸48連接的多泛素鏈以及穩定cAMP反應性元素結合蛋白(CREB)的轉錄活化來控制肝細胞中ZNF638的蛋白質水平。USP7/ZNF638軸調節ACACA、FASN和SCD酶介導的肝臟DNL途徑，USP7/ZNF638軸通過AKT/mTORC1/S6K信號傳導選擇性地提高了裂解的SREBP1c在細胞核中的積累，并形成了USP7/ZNF638/SREBP1C核復合物來激活FASN等脂質發生酶促進DNL，但不影響SREBP1C全長蛋白[15]。

脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)是DNL途徑的重要參與者。研究發現，SNX8(sorting nexin 8，SNX8)是FASN介導的NAFLD進展的潛在抑制因子，其顯著降低了脂肪酸合成和炎癥反應相關基因的mRNA表達。SNX8通過招募TRIM28(一種E3連接酶)進行K48連接多聚泛素化，同時增強TRIM28與FASN相互作用，誘導FASN蛋白酶體降解[16]。AMP依賴的蛋白激酶(adenosine 5‘-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)是肝臟代謝穩態的重要能量傳感器，包含有多種異源三聚體復合物，在NAFLD進展中參與調控肝臟脂肪變性與肝臟炎癥。AMPK的活化可抑制DNL途徑，并且可減少脂肪組織中游離脂肪酸的釋放，從而防止肝脂肪變性。此外，AMPK可以通過抑制NLRP3炎癥小體的激活防止肝臟炎癥[17]。Makorin無名指蛋白1(makorin ring finger protein 1,MKRN1)是肝臟和脂肪細胞組織中AMPK的E3泛素連接酶。最近研究表明，盡管AMPK具有慢性激活和獨立作用復雜性的特點，但MKRN1的抑制足以長期激活肝臟和脂肪組織中的AMPK，進而抑制肝臟脂質積累和炎癥的發生[18]。

2.1.2 脂肪酸氧化

脂肪酸氧化(fatty acid oxidation,FAO)亦是肝臟調節脂質代謝的四種途徑之一，其過程中產生大量的活性氧(ROS)、氧化應激和有毒的二羧酸可能會促進炎癥和疾病進展[13]。Nrf2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)是細胞抗氧化應激的主要調節因子，主要負責誘導解毒和抗氧化酶的表達。Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)是調節Nrf2活性的E3泛素連接酶[19]。Nrf2的活性受Keap1的嚴格調控，在生理條件下，Nrf2通過與Keap1的相互作用被蛋白酶體降解形成復合體。當細胞受到氧化應激刺激時，Nrf2從復合體中解離并轉位到細胞核中，與抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)結合，從而啟動抗氧化反應。KEAP1-NRF2-ARE軸是一種重要的毒性途徑，如果其受到干擾，會產生不良的健康問題。[20]嘌呤霉素敏感性氨肽酶 (puromycin-sensitive aminopeptidase, PSA)是肝臟脂質代謝的關鍵調節因子，負責催化多肽n端附近氨基酸的裂解，同時參與脂肪生成和脂肪酸b氧化。有研究發現，PSA通過抑制Nrf2的泛素化，進而激活Nrf2和下游的抗氧化酶來減輕氧化應激并減輕脂肪變性[21]。

2.2 炎癥反應

肝臟中的炎癥反應促進了NASH的發展以及隨后肝纖維化、肝硬化、肝癌的進展。在NAFLD中，炎癥的觸發可能來自肝臟外(如腸道)或者器官內(如細胞死亡途徑)。隨著炎癥活動的持續，導致肝臟中發生慢性炎癥變化，使處于亞致死脂肪毒性損傷狀態的肝細胞進一步損傷，從而加劇肝臟組織損傷，并可能出現異常的傷口愈合反應，促進NASH和肝纖維化的發展[22]。

JNK和NF-κB是參與NAFLD慢性炎癥發展的主要炎癥通路。JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族的成員之一，與細胞凋亡的激活和NASH的發展有關。NF-κB是炎癥激活的主要調節因子，其中的IKK2亞基是其在急性炎癥反應中激活所需的主要成分[23]。TNF-α誘導蛋白3(TNF alpha induced protein 3,TNFAIP3)是一種泛素編輯酶，其通過干擾NF-κB信號蛋白的泛素化以及去泛素化來抑制NF-κB信號級聯反應[24]。TNFAIP3相互作用蛋白3(TNFAIP3 interacting protein 3,TNIP3)在NASH進展中是TAK1激活的新抑制因子。研究表明，TNIP3通過其AHD1結構域與TAK1結合，阻止其被E3連接酶TRIM8泛素化，進而抑制了TAK1的激活及其下游的IKKb-NF-ΚB和MKK7-JNK信號級聯的激活，從而減輕NASH的肝損害。同時，TNIP3的去泛素化完全獨立于與TNFAIP3相關的去泛素化。同時，在NASH環境下，TNIP3的AHD1結構域決定其與TAK1的相互作用以及其下游的MKK7-JNK和NF-ΚB信號的激活。因此，TNIP3的AHD1結構域可能是消除代謝應激誘導的炎癥和代謝失調的精確靶點，且不會損害肝細胞抵抗宿主內入侵病原體的能力[25]。此外，腫瘤壞死因子受體相關因子6 (TNF receptor associated factor 6,TRAF6)在因TGF-β激活TAK1介導的IKK、JNK和p38通路中至關重要，TAK1上的K158可被TRAF6泛素化[26]，TAK1-K158是受TNIP3表達影響的特異性泛素化位點。該研究認為，這一發現豐富了TNIP3作為炎癥反應和代謝失調反應中TAK1激活抑制劑的功能，這在未來可能作為一種新的替代治療策略來調節NASH過程中的TAK1過度激活[25]。

ASK1通路在NAFLD和纖維化的發展中起著至關重要的作用。ASK1被ROS、TNF-α、內質網應激等應激源激活，進而誘導下游p38MAPK和JNK信號通路的激活，參與調節脂滴自噬、細胞凋亡及炎癥[27]。泛素醛結合蛋白1(OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding protein 1, OTUB1)是細胞中最豐富的dub之一，它能結合E2酶并且通過調節E2泛素結合物使其作為抑制劑參與各種泛素化過程[10]。OTUB1在機體內調控多種代謝相關信號分子，如MAPK、mTORC1、FOXM1和p53、和AKT等。實驗研究表明，ASK1是OTUB1的關鍵候選靶點，其既可以直接切割靶蛋白中泛的素鏈，又可以通過阻斷特定泛素偶聯酶的功能來間接抑制泛素化。肝細胞中的TRAF6通過促進ASK1的賴氨酸6連接的多聚泛素化，加重肝纖維化和炎癥。在NASH的進展中，OTUB1通過直接與TRAF6結合，抑制其賴氨酸63連接的多聚泛素化，從而抑制ASK1及其下游ASK1- JNK/p38通路的磷酸化，進一步抑制下游TRAF6-ASK1信號級聯[28]。

表1 泛素蛋白酶體系統調控NAFLD機制

2.3 內質網應激障礙

內質網是分泌蛋白質和脂質代謝的主要細胞器，其對游離脂肪酸的損傷很敏感，導致未折疊或錯誤折疊的蛋白質的積累，從而激活了未折疊蛋白的反應，如果未折疊蛋白反應失敗，應激傳感蛋白如肌醇需要酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)會觸發自噬通路，IRE1剪接并激活轉錄因子XBP1，XBP1通過激活JNK、NF-ΚB信號通路和產生ROS參與各種炎癥級聯反應。此外，UPR主要通過激活泛素化相關基因和自噬相關基因來調控UPS和自噬[29]。

越來越多的研究發現，UPS在內質網應激過程中發揮著重要的作用，一些E3連接酶通過泛素化內質網應激相關蛋白進而間接調控內質網應激過程[8]。HMG-CoA還原酶降解蛋白1(the HMG-CoA reductase degradation protein 1, Hrd1)是內質網應激通路中的一種E3連接酶，通過調節酵母中限速酶HMGCR的周轉來控制膽固醇的產生。細胞內蛋白質翻譯后的一個重要修飾是內質網相關降解(endoplasmic reticulum associated degradation，ERAD)，Hrd1在ERAD中發揮關鍵作用，并保護細胞免受內質網應激引起的細胞死亡。此前研究表明，Hrd1還被證明催化內質網應激傳感器IRE1α的泛素偶聯，以抑制細胞凋亡和控制腸道干細胞的穩態。Hrd1的調控功能是通過泛素化介導的蛋白降解來實現的，Hrd1可通過多種分子機制發揮代謝調節作用，其介導的ENTPD5泛素化降解可能是肝臟代謝調控的關鍵途徑。該研究認為，由于Hrd1的組織和器官特異性功能在很大程度上還未得到研究。因此， Hrd1的抑制劑治療NAFLD的可行性尚需進一步研究[30]。最新關于Hrd1的實驗研究表明，Hrd1作為肝臟中檸檬酸裂解酶 (ATP citrate lyase，Acly)和脂質合成的新型負調控因子，對NAFLD的改善具有重要的作用。Acly是脂肪再生的關鍵酶，在依賴葡萄糖的從頭脂肪生成過程中發揮了關鍵作用，其裂解檸檬酸生成乙酰輔酶a，該過程是線粒體外脂質合成的基礎。Hrd1作用于Acly的泛素化并降解Acly，從而降低其蛋白水平，致使乙酰輔酶a水平的降低和肝細胞脂質合成受到抑制，減輕脂肪變性。此外，在胰島素抵抗環境中，Hrd1通過介導Acly降解來抑制脂質代謝中新生脂質合成和甘油三酯積累，同時改善胰島素抵抗與脂質誘導的細胞損傷[31]。

3 結語與展望

泛素蛋白酶體途徑作為細胞內主要的蛋白質水解途徑之一，參與NAFLD發生發展的不同途徑及過程。不同的泛素化和去泛素化酶作用于不同的靶點及通路，起著不同的調控作用。NAFLD涉及脂質代謝、自噬、氧化應激等多個方面，盡管泛素蛋白酶體系統相關靶點逐漸被關注，但由于泛素蛋白酶體系統的多樣性、復雜性以及NAFLD發病機制的復雜性，泛素蛋白酶體系統相關靶點待進一步研究，為未來的NAFLD特效藥物的開發提供思路。