CRISPR/Cas9技術在節肢動物中的應用研究

黃津偉 胡樂貞 齊佳辰 孫金生 李冉

摘要 CRSPR/Cas9系統是基于RNA的適應性免疫系統，廣泛存在于細菌和古細菌中。其特點在于單個蛋白質Cas9與兩個短RNA序列結合后，可作為位點特異性核酸內切酶在體內或體外發揮作用。與傳統的由核酸酶介導的DNA編輯技術不同，CRISPR/Cas9對DNA的識別不是由蛋白質指定的，而是由 20-nt向導RNA（guide RNA）序列指定的。CRISPR/Cas9系統由于其設計過程和使用過程簡單高效而被廣泛應用?？偨YCRSPR/Cas9系統作用機理、導入方法及其在節肢動物中不同類群及不同基因的應用進展，以期為重要農業及經濟節肢動物的功能基因研究與遺傳育種研究提供有價值的參考。

關鍵詞 CRISPR/Cas9;導入方法;節肢動物;基因編輯

中圖分類號 Q78? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）01-0001-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.001

Research on the Application of CRISPR/Cas9 Technology in Arthropods

HUANG Jin-wei， HU Le-zhen， QI Jia-chen et al

（College of Life Sciences，Tianjin Normal University， Tianjin 300387）

Abstract The CRISPR/Cas9 system is an RNA-based adaptive immune system which exists in bacteria and archaea. Its characteristic is that following the compound of a single protein Cas9 with two short RNA， it can act as a site-specific endonuclease in vivo/in vitro. Unlike traditional nuclease-mediated DNA editing technology， the recognition of DNA by CRISPR-Cas9 is not specified by the protein， but by the 20-nt guide RNA （guide RNA） sequence. The CRISPR-Cas9 system is widely used due to its simplicity in design， use and high efficiency. Summarizes the mechanism of CRSPR/Cas9 system， the introduction method and the application progress of different groups and different genes in arthropods， in order to provide a valuable reference for the research of functional genes and genetic breeding of important agricultural and economic arthropods.

Key words CRISPR/Cas9;Introducing method;Arthropod;Gene editing

基金項目 “藍色糧倉”國家重點研發計劃子課題（2018YFD0901301）。

作者簡介 黃津偉（1997—），女，天津人，碩士研究生，研究方向：水生生物學。

通信作者，孫金生，研究員，從事重要水產動物疾病的發生和免疫防治研究;李冉，副教授，從事重要水產動物生長生理及分子育種研究。

收稿日期 2021-08-01;修回日期 2021-08-23

基因組編輯技術是研究各種生物體靶基因功能的有效手段，在CRISPR/Cas9系統被發現之前，鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）和轉錄激活因子樣效應核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）技術常用于基因編輯，這2種技術均可用于設計DNA結合域，可以有效地識別和修改基因序列，被廣泛應用于各個領域。然而鋅指核酸酶和轉錄激活因子樣效應核酸酶需要使用多種核酸酶，核酸酶的脫靶效應會導致細胞毒性，且使用方法較為復雜[1]，因此這2個基因組編輯系統最近被CRISPR/Cas9系統取代。CRISPR/Cas9系統進行基因編輯簡單高效，已被廣泛用于哺乳動物。

節肢動物物種繁多，包括與農林漁業相關的諸多物種，了解相關物種的基因功能從而在農林漁業中合理應用是非常重要且必要的。CRISPR/Cas9已應用于節肢動物的部分物種，筆者對已成功應用的物種及研究進展進行總結，以期為重要農業及經濟節肢動物的功能基因研究與遺傳育種研究提供有價值的參考。

1 CRISPR/Cas系統

1.1 CRISPR/Cas的作用機理及類型

CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR associate proteins）系統最早發現于細菌內，是以RNA為基礎的適應性免疫系統，主要防御外來核酸的侵染，維持細菌自身正常生命代謝活動[2]。CRISPR/Cas系統由反式激活CRISPR RNA基因（tracrRNA）、Cas操縱子和CRISPR DNA區域3部分組成，其中CRISPR由一組重復間隔序列及多個非重復間隔序列組成，非重復間隔序列是早先侵入細菌內的病原體核酸片段經過不斷進化形成的。tracrRNA作為一種獨特的非編碼RNA，與CRISPR間隔序列具有同源性。Cas操縱子目前已發現有多種，如Cas9、Cas1、Cas2和Csn2，可經轉錄翻譯生成Cas蛋白（核酸酶）。當侵染過的病毒再次入侵細胞，CRISPR DNA區域轉錄生成前體CRISPR RNA（pre-crRNA），tracrRNA與pre-crRNA通過堿基互補配對及RNA酶的作用形成成熟的crRNA[3]。crRNA與tracrRNA組成單鏈導向RNA（sgRNA），并利用細菌中的核酸酶進一步修飾crRNA的5′端，使其長度最終減少到20 nt。當crRNA下游存在特定的前間區序列鄰近基序（PAM）時，Cas蛋白將被引導至入侵病原體DNA與crRNA互補的位點處進行切割，完成免疫過程?；谏鲜鲞^程，有研究者提出可以在體外合成sgRNA模擬體內crRNA和tracrRNA的結構，并與Cas9結合形成CRISPR/Cas9系統。Jinek等[4-5]研究出利用sgRNA對特定DNA進行剪切的核酸酶系統，首次證明了CRISPR/Cas9可以被應用于基因工程。Mali等[6-7]創建CRISPR/Cas9系統并應用于基因編輯。由于其設計使用較為簡單且有效，CRISPR/Cas系統得到了生物學屆和醫學界的廣泛關注，并廣泛應用于基因編輯、轉錄擾動、表觀遺傳調節和基因組成像等相關研究[8]。根據目前CRISPR/Cas位點的分類[9]，CRISPR系統被分為6種不同的類型（I～VI），各類型都使用特定的Cas蛋白和crRNA。相比其他系統來說，II型系統的結構最簡單，即CRISPR/Cas9系統。

1.2 CRISPR/Cas9的修復機制

Cas9蛋白包含2個結構域，其中HNH結構域可剪切與sgRNA互補的靶DNA鏈（目標鏈），RuvC結構域則剪切另外一條核酸鏈，造成目標DNA的雙鏈斷裂（double-strand DNA break，DSB）。雙鏈斷裂后細胞內會啟動修復機制，細胞在不同的分裂時期會啟動不同的修復機制。每個細胞分裂時期都可以發生非同源修復機制（nonhomologous end joining，NHEJ），這種機制不需要同源模板存在。DNA雙鏈斷裂后修復酶會對斷裂末端進行酶切修飾，便于DNA連接酶將斷裂的兩端DNA重新連接在一起，這種修復方式易在斷裂位點出現堿基插入或缺失，且通常會產生移碼突變，從而導致蛋白質翻譯的提前終止，轉錄物降解或蛋白質丟失。另一種細胞修復機制只能發生在細胞分裂間期，它需要同源修復模板，稱為同源修復機制（homology-directed repair，HDR），模板可以是ssDNA或dsDNA，在導入CRISPR/Cas9的同時，需要提供帶同源臂的供體DNA作為整合模板，其可以攜帶外源DNA序列從而引入新的基因。CRISPR/Cas9系統也是當前應用最多的系統可以利用非同源修復機制使目的基因轉錄失敗或使目的蛋白失去功能，進而實現基因敲除，在哺乳動物中的成功率較高，Cas9中的HNH結構域可以利用多個sgRNA通過非同源修復機制實現一個試驗中多個靶基因（序列較短）的突變[7，10]，也可通過引入2個sgRNA敲降較長的基因組片段。

1.3 CRISPR/Cas9系統的導入方法

1.3.1 CRISPR/Cas9系統的封裝方式。

目前導入CRISPR/Cas9的方式有很多，分別可以mRNA、DNA、蛋白-核酸的形式引入。在RNA水平上，2015年Hruscha等[11]將sgRNA和Cas9 mRNA通過顯微注射導入到斑馬魚胚胎中，對斑馬魚基因組進行編輯;在DNA水平上，主要通過質?；虿《窘閷NA導入;在蛋白質-核酸水平上，通常在體外表達Cas9蛋白，并與sgRNA孵育結合形成Cas9蛋白-sgRNA復合體后將其導入受精卵或細胞中進行基因編輯[12-13]。

1.3.2 顯微注射法。

顯微注射法是將外源基因導入胚胎的最常見且最直接的方法，在節肢動物的模式生物中應用較為廣泛，也是當下CRISPR/Cas9導入的主要技術。但顯微注射技術仍在應用方面存在一些阻礙：例如部分節肢動物的卵膜會在排卵后很快變硬導致在注射時胚胎破裂，由于卵細胞內外滲透壓不同造成注射時內容物的外流等。目前研究人員針對不同情況已經提出了相應的解決方法，對于卵膜硬化問題，解決的方法是選擇合適的時間，在產卵后應立即收集胚胎，將卵置于某些試劑（如蔗糖、次氯酸鹽）中[13-14]或置于冰上，防止卵膜變硬;而對于卵細胞滲透壓差異問題，平衡滲透壓是最有效的解決方法，海洋動物的卵或胚胎可以放在海水中[15];探索合適的培養條件，如Hiruta等[16]提出水蚤中分離的胚胎培養于2%瓊脂、60 mmol/L蔗糖的培養基上最有利于顯微注射。雖然顯微注射技術目前應用得相對廣泛，但由于需要精密昂貴的注射設備、高難度的操作技術且成活率較低，研究者們在積極探求更優的技術方法。

1.3.3 精子介導法。

1971年首次報道了精子能攜帶異源基因整合到受精卵中[17]，1989年Lavitrano等[18]將外源DNA與小鼠精子在等滲溶液中孵育15 min，在后代中檢測出外源基因被帶入受精卵，證明精子細胞具有吸收外源DNA并將其攜帶到卵細胞的能力。但是，由于精子是成熟的生殖細胞，無法在分裂之前選擇成功整合外源DNA的細胞，即使精子進入卵細胞后在受精卵或子一代中成功轉入外源基因，也可能是以染色體外形式存在，而不是整合到宿主基因組中[19]。2008年Wu等[20]將109個精子和50～300 mg DNA在體外17 ℃孵育，后經人工授精，檢測到仔豬存在轉基因個體，但70～90 d齡的仔豬均未檢測到外源DNA，表明精子攝取DNA僅在早期傳遞給后代，研究人員推測是由于早期細胞分裂復制過程導致外援DNA丟失。為了優化精子介導法，研究者進行了多種嘗試，例如使用線性化質粒[18]、通過轉染試劑優化DNA轉移[21]，并且發現精子攝取DNA效率與精子的運動性高度相關[20]。目前精子介導基因轉移技術已經在小鼠[22-23]、牛[24-25]、豬[23]、雞[26-27]、魚類等生物中得到一定改良和應用，2014年Xin等[28]發現海洋魚類精子由于精漿中存在DNA酶，攝取外源DNA能力較弱，可通過除去精漿并用脂質體包裝DNA的方法實現精子介導基因轉移。精子介導法有操作簡便、成本低廉的優點，通過精子介導CRISPR/Cas9到節肢動物的受精卵或胚胎也作為引入CRISPR/Cas9的可行性方法受到研究者的關注，但在節肢動物中尚未報道。

1.3.4 納米顆粒介導法。

用納米顆粒包裝CRISPR/Cas9系統進入細胞可以增大體內細胞對CRISPR/Cas9系統的內化率，克服離體基因編輯的限制，為內容物分子提供屏障以防止降解，還可通過設計納米顆粒的結構和成分，靈活實現靶向特定的組織。CRISPR/Cas9進入細胞的3種方式產生的復合物與質粒均可以被納米顆粒包裝進入細胞[29-31]。對于通過納米顆粒包裝CRISPR/Cas9系統進入細胞來說，以Cas9 mRNA和sgRNA混合物的方式進行包裝優于Cas9-sgRNA質粒包裝，原因在于質粒DNA中包含了大量非編碼序列，長度較大，使得包裝難度高[32]。此外，mRNA可以直接在細胞質中進行翻譯，不需整合到宿主基因組中，沒有插入誘變的風險，脫靶率較低，質粒則需要進入細胞核中完整進行轉錄和翻譯的過程。當前各種納米顆粒的應用有很多，例如兩性離子氨基脂質（zwitterionic amino lipids，ZALs）納米顆粒[33]、外泌體-脂質體雜合納米顆粒[34]、脂質納米顆粒[35]和陽離子類脂質納米顆粒[36-37]等都實現了遞送CRISPR/Cas9進入細胞并實現基因編輯。但由于納米顆粒傳導法前期制備方法復雜、成本較高，因而在一定程度上限制了其在基因編輯操作中的廣泛應用。

1.3.5 病毒介導法。

以病毒為載體導入CRISPR/Cas9主要用到的是慢病毒（lentivirus）、腺病毒（adenovirus）和腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）。慢病毒可以將外源DNA整合到宿主染色體中，形成穩定遺傳的細胞系，但毒性較大，感染效果較差。腺病毒感染效果好，但免疫原性高、維持時間短。目前比較成熟的是腺相關病毒，它的免疫原性低，并且有多種血清型可以靶向不同的器官或組織，但是AAV的裝載能力比較差，需要構建雙載體進行導入。研究中用的比較多的是釀膿鏈球菌Cas9（spCas9，～4.2 kb）。例如Ran等用來自金黃色葡萄球菌的Cas9蛋白（saCas9，～3.2 kb）代替spCas9，從而將sgRNA和Cas9構建于一個載體中[38-39]。以上3種病毒介導CRISPR/Cas9進入細胞或胚胎的技術較為成熟，但是它們只能侵染哺乳動物，無法感染節肢動物，因此無法應用于節肢動物轉基因工作。目前廣泛應用于節肢動物轉基因工作的病毒載體是桿狀病毒（baculovirus）[40]。Zhu等[41]通過磁性納米粒子-桿狀病毒載體（MNP-BVs），在磁場的作用下介導CRISPR/Cas9系統進行體內靶向基因編輯。Dong等[42]構建桿狀病毒誘導CRISPR/Cas9系統進入昆蟲細胞，在很大程度上降低了脫靶效應。Naik等[43]研究發現加州苜蓿多核多角體病毒（AcMNPV）可以有效地介導外源基因進入蚊子細胞，通過合適的啟動子誘導高效表達基因，而且對細胞繁殖和生存力沒有明顯消極影響。對于基因組信息尚未解析的物種，無法確定高效啟動外源基因表達的啟動子，因此在這些物種中使用病毒介導外源基因的技術還不成熟。

1.3.6 卵黃蛋白原介導法。

大多數卵生動物雌性在卵巢發育的過程中會向卵細胞中輸送蛋白質，其中最重要的是卵黃蛋白的輸入。在昆蟲和其他節肢動物中，卵黃蛋白前體（yolk protein precursors，YPPs）在脂肪體中合成，分泌到血淋巴，并通過受體介導的內吞作用進入卵巢。在卵黃發生過程中，卵母細胞膜上有多個受體，并與YPP配體結合，這些配體被內吞進入小泡中，并被分選為卵黃顆粒，為發育中的胚胎儲存營養物質[44]。Chaverra-Rodriguez等[44]發現節肢動物卵黃蛋白原前體的配體可以與Cas9整合成重組蛋白，從而將Cas9-sgRNA帶入卵內?？梢酝ㄟ^將與CRISPR系統整合的卵黃蛋白原前體注射到甲殼動物的血淋巴中，同時引入胞漿的內吞小泡釋放劑（主要為氯奎、皂素），防止進入的復合物局限于小泡而不被釋放導致基因編輯成功率降低，使用這種方法進行基因編輯的編輯效率為30%。該方法操作要求低，目前已成功應用于麗蠅蛹集金小蜂、斯氏按蚊等物種[45-46]。

1.3.7 電穿孔轉導法。

電穿孔傳導法是利用電場震動細胞，使細胞膜出現孔道，流動性增加，從而使帶電的外源基因實現轉移[2，47]。DNA或其他帶電分子通過高電壓在細胞膜上制造暫時的穿孔進入細胞，可以通過這些小孔。在一次電穿孔試驗中可以有多個胚胎同時作為試驗材料，相比顯微注射有更高的效率。但對于體內基因編輯來說，電穿孔會對細胞造成損傷，當下主要將其用于體外基因編輯研究中。在嚙齒動物中已使用電穿孔技術導入CRISPR系統并成功完成基因編輯[48-50]。根據試驗物種特異性，不同的物種適用于不同的傳遞方法，也可以同時應用2種導入方法來增加基因編輯的成功率[51]。

2 CRISPR/Cas系統在節肢動物中的應用

節肢動物包括的物種眾多，與農業、林業、漁業、公共衛生等領域密切相關。因此將CRISPR/Cas9系統應用于節肢動物會為人類社會創造極大的價值。

2.1 甲殼動物中的應用

2.1.1 水蚤。

水蚤（Daphnia）的研究歷史非常深遠，在水生食物鏈中占有重要地位。在水生毒理學和對環境的適應性影響，使其成為環境、生態、進化和發展基因組學研究的重要模型。水蚤的完整基因組于2011年測序完成[52]，為研究甲殼動物基因功能和CRISPR/Cas系統的應用提供了基礎。

2.1.1.1 建立基因編輯模型。

2014年Nakanishi等[53]首次報道CRISPR/Cas9在大型蚤（Daphnia magna）中成功突變無眼基因（eyeless）。通過顯微注射將Cas9 mRNA和sgRNA導入受精卵中，后代有18%～47%眼部出現異常，成熟后眼睛變形率高達8.2%。Kumagai等[54]通過顯微注射將Cas9/gRNA核糖核酸蛋白（RNPs）注入水蚤受精卵中，發現D.magna中包含純化的Cas9蛋白和gRNA的Cas9 RNP的切割活性，后將Cas9蛋白與無眼基因gRNA一起溫育并注射到D.magna卵中，得到典型的無眼突變體表型。Hiruta等[55]組裝靶向Distal-less基因（Dll）的sgRNA，該基因是編碼無脊椎動物和脊椎動物遠端肢體發育必不可少的同源域轉錄因子，研究者將Cas9 RNP顯微注射至淡水枝角水蚤（Daphnia pulex）受精卵中，注射的胚胎顯示出第二觸角的形成缺陷和附肢的發育紊亂，在Dll基因座中檢測到插入缺失突變。此外，DapmaSt是大型蚤（D.magna）眼睛中黑色素沉著必須的基因，因此常被選來作為大型蚤的顏色標記基因，Ismail等[56]通過顯微注射Cas9 mRNA和靶向DapmaSt的sgRNA，建立了眼點白化的DapmaSt突變株。

2.1.1.2 5-羥色胺影響的信號通路。

5-羥色胺具有調節動物的發育、生長、繁殖和行為的關鍵功能。Campos等[57]在水蚤（Daphnia magna）中通過CRISPR/Cas9系統分別構建了5-羥色胺（Tryptophan hydroxylase，TRH）單等位基因和雙等位基因缺失的突變體，與野生型個體相比單等位基因突變體生長更慢、繁殖更晚，雙等位基因突變體變型更顯著。轉錄組學和功能基因分析顯示TRH突變體的生長、蛻皮和能量代謝信號通路基因都出現下調，缺少5-羥色胺的雙等位基因突變體呈現出5-羥色胺酸突觸和花生四烯酸的代謝途徑被下調，色氨酸至犬尿氨酸代謝途徑中的基因被上調表達，從而表明了5-羥色胺酸與花生四烯酸的代謝途徑之間存在相互作用關系，對胰島素生長因子介導的信號通路的影響很小[58]。

2.1.1.3 選擇環境性別決定激活劑。

轉錄因子Doublesex（Dsx）調節通路的差異是動物性別決定機制進化的基礎，但是目前關于環境性別決定中Dsx的調控知之甚少。在D.magna中，環境性別決定是通過Dsx直系同源基因Dsx1的雄性特異性表達來實現的。Mohamad等[59]使用CRISPR/Cas9在水蚤（Daphnia magna）雄性基因組的目標位點引入突變，破壞D.magna雄性基因組上Dsx1增強子導致Dsx1表達的降低。通過CRISPR/Cas9定向誘導，確定Vri為Dsx1的轉錄激活因子，表明基因調控網絡在性別決定中具有顯著的可塑性。

2.1.1.4 研究蛻皮類固醇在水蚤早期胚胎中的作用。

蛻皮類固醇是調節節肢動物生長、繁殖和胚胎發生的重要激素，但是蛻皮類固醇在水蚤中各個時期的表達情況及作用，尤其是早期胚胎中研究尚不明確。Adhitama等[60]用CRISPR/Cas9生成含蛻皮激素響應原件（EcRE）和報告基因（mCherry）的轉基因水蚤，命名為EcRE-mCh。EcRE-mCh系統的建立及其在時空上表現出蛻皮甾體活性的能力，為闡明動物體內早期蛻皮甾體作用提供基礎。此外EcRE-mCh還可用于監測環境水中蛻皮類固醇的活性。

2.1.2 脊尾白蝦。

脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）是重要的經濟物種，它的繁殖周期為60 d，在實驗室環境中可以全年保持繁殖能力，因此在基礎研究中比其他蝦種更有優勢。它的基因草圖已經完成，基因組裝覆蓋了95%以上的編碼區[61]。近年來CRISPR/Cas9在脊尾白蝦中的應用總結見表1。

2.1.3 夏威夷明鉤蝦。

夏威夷明鉤蝦（Parhyale hawaiensis）廣泛分布于熱帶淺水生境中，近10年中，已經成為遺傳和分子細胞生物學研究中最有力的甲殼綱動物模型于2014年成功應用了CRISPR/Cas9系統[53]。2018年Jarvis等[67]利用合成sgRNA和CRISPR/Cas9敲除夏威夷明鉤蝦的Hox基因，研究Hox基因在附肢鑒定中的相互作用。

2.2 節肢動物中其他物種的應用

2.2.1 果蠅。

果蠅（Drosophila）屬于節肢動物門（Arthropoda）、昆蟲綱（Insecta）、雙翅目（Diptera），是典型的模式生物，廣泛存在于熱帶與溫帶之間。容易飼養、繁殖周期短、性狀豐富等特點讓它成為典型的模式生物，發育過程經歷卵、幼蟲、蛹、成蟲4個階段。果蠅細胞系適用于生化試驗、轉錄組學、功能基因組學和生物醫學等研究。目前，針對果蠅細胞系開發了基于CRISPR/Cas9的功能基因組學。CRISPR/Cas9系統在果蠅中的研究已經非常廣泛，表2中列舉了近3年取得的重要進展。

2.2.2 蚊科。

昆蟲綱（Insecta）、雙翅目（Diptera）中的蚊科（Culicidae）是多種疾病的傳播載體及阻斷疾病傳播的研究對象，因此在傳染病中對蚊體內調控與病毒共存的相關基因進行基因編輯是目前防控的研究熱點。

在瘧疾的防控研究中，了解按蚊（Anopheles）傳播瘧疾寄生蟲的寄生分子機制對阻斷疾病傳播非常重要。按蚊的中腸、血淋巴和唾液腺中物質與瘧原蟲感染息息相關，蚊-瘧原蟲相互作用的關鍵物質是阻斷傳播的靶點?？刂漂懺x感染的一個明顯優勢是可以通過多種手段進行調控，如激動劑基因缺失，RNAi介導的基因沉默，或通過抗體或小分子干擾。然而，由于缺乏針對按蚊的有效的基因編輯工具，在探索制定瘧疾控制策略方面仍落后于其他方法。最近開發的基于CRISPR/Cas9的按蚊基因組編輯方法為瘧原蟲宿主因子的研究提供了新的和有前景的工具。瘧原蟲在蚊媒傳播途徑中需要多種激動劑的參與，在轉錄前或轉錄后干擾相關激動劑成為控制瘧疾蚊媒傳播的途徑，纖維蛋白原相關蛋白1（FREP1）是蚊媒傳播途徑中激動劑的一種，Dong等[73]通過CRISPR/Cas9突變FREP1，發現FREP1突變的成年按蚊，在卵囊和子孢子階段對人和嚙齒類瘧疾寄生蟲的感染均被顯著抑制。但是，FREP1的失活也影響了突變后代多種生命活動過程，包括顯著降低采血傾向、繁殖力和卵孵化率、化膿時間延遲以及血餐后壽命降低。

伊蚊（Aedes）作為傳播登革熱、寨卡、基孔肯雅熱病毒的媒介也被廣泛關注，但是缺乏對基因的功能、進展進行研究的工具。Liu等[74]通過向伊蚊胚胎注射Cas9-sgRNA RNP對犬尿腎上腺素羥化酶（kynurenine hydroxylase，kh）和多巴色素轉化酶（dopachrome conversion enzyme）進行突變，發現可育伊蚊中有30%～50%產生突變，在子代蛹和成蟲中觀察到眼睛和身體色素沉著缺陷。Ling等[75]使用CRISPR-Cas9基因編輯方法破壞埃及伊蚊Aa5HT2B基因，導致其體型減小、發育延遲、壽命縮短、卵巢生長受阻、脂質積聚顯著減少、胰島素樣肽（ILP）基因ilp2和ilp6的表達下調及ilp5和ilp4的表達上調。結果表明，Aa5HT2B與ILP6之間存在調節聯系。這些研究表明，可以用CRISPR/Cas9介導的基因編輯系統作為伊蚊基因組規模分析和生物學研究的有效工具來防控多種疾病。

2.2.3 家蠶。

昆蟲綱（Insecta）、鱗翅目（Lepidoptera）中的家蠶（Bombyx mori）作為典型的工業物種一直為很多地區提供經濟支持，但是大規模飼養容易遭受病毒的迫害，通過CRISPR/Cas9技術對家蠶基因進行改造，增強家蠶抗病能力有望成為提高家蠶經濟應用價值的新興技術。

2.2.3.1 靶向敲除病毒。

Dong等[76]在家蠶中構建了載體系統（pSL1180-Cas9-U6-sgRNA）包含多重sgRNA和Cas9蛋白，靶向突變家蠶細胞中的核型多角體病毒（BmNPV）。此外還構建了多重編輯載體（PSL1180-Cas9-sgIE1-sgLEF11-sgGP64，sgMultiple）來有效地進行基因突變，在病毒入侵后抑制病毒的復制。這一多重系統可以顯著提高基于CRISPR/Cas9的多重基因組工程在昆蟲病毒研究中的潛力[77]。

2.2.3.2 研究生長發育基因用于育種。

CRISPR/Cas9也被用于突變生長發育相關基因，Xu等[78]使用CRISPR/Cas9突變家蠶中的Hpo基因導致身體大小調節和發育出現缺陷、色素積聚、早逝，表明Hpo對于調節家蠶的生長和發育至關重要。Liu等[79]使用CRISPR/Cas9對家蠶TCTP進行突變導致三齡幼蟲發育停滯并致死，研究發現生長損傷是由于細胞減少，并且腸上皮細胞的增殖和分化也受到影響，家蠶TCTP突變顯著影響碳水化合物代謝、脂質代謝和消化系統，表明BmTCTP在控制幼蟲的生長和發育中起關鍵作用。

2.2.3.3 防控蟲害。

Xu等[80-82]通過在家蠶中利用CRISPR/Cas9技術介導基因突變探索卵特異性蛋白（egg-specific protein，Esp）、卵巢絲氨酸蛋白酶（ovarian serine protease，Osp）和Yorkie的基因功能。卵特異性蛋白是家蠶卵黃蛋白原的一種，研究發現Esp突變導致雌性不育，突變個體產出卵較小、顏色淺、不能孵化，這種變化可以遺傳給后代;Osp突變也會導致雌性不育，突變體產卵量少于野生型雌性，卵也不會孵化;Yorkie的缺失導致身體尺寸縮小、蛻皮缺陷，并最終導致幼蟲死亡。Esp和Osp對雌性生殖至關重要，Yorkie是Hippo信號通路的關鍵下游效應子，可以作為害蟲管理的潛在靶標。

2.2.3.4 研究ITPR在信號網絡中的作用。

Sun等[83]利用CRISPR/Cas9突變ITPR，ITPR是昆蟲離子轉運肽（ITP）的受體，作為多種生理過程的調節劑。研究發現家蠶ITPR突變導致幼蟲期延長了3.5 d，翅膀展平失敗，消化道中食物遷移速度是野生型1.55倍，幼蟲階段排泄量是野生型1.56倍，導致體內水分的流失，一氧化氮合酶酶活性和一氧化氮（NO）含量以及下游Ca2+/NO/cGMP信號通路相關分子顯著上調，胰島素和蛻皮激素信號通路中的關鍵基因也受到影響，表明ITPR在調節家蠶水的體內穩態和發育中起關鍵作用。

2.2.3.5 確定Ovo在家蠶中的作用。

Bi等[84]使用CRISPR/Cas9系統突變Ovo基因。Ovo是果蠅種系性別確定中重要基因的同源物。研究發現Ovo突變體的卵形異常，在卵巢中排列無序，性腺發育異常，翅膀不能正常發育，Ovo基因在翅原基和表皮中表達量升高。與野生型動物相比，在Ovo突變體中，涉及Wnt信號通路的基因和翅膀發育基因WCP10和E74被下調。這些結果表明，BmOvo基因在翅變態中起重要作用。

2.2.3.6 其他應用。

Zhang等[85]利用CRISPR/Cas9系統蜘蛛絲蛋白基因成功整合到家蠶基因組中。所得纖維的強度與天然蜘蛛絲一樣強（1.2 GPa抗拉強度），證明了將家蠶作為天然蜘蛛絲生產者用于工業生產高性能纖維的可行性。此外，Li等[86]證明了CRISPR/Cas9依賴性堿基編輯器（BE3）在家蠶中的使用效率，BE3是一種新的CRISPR工具，無需將DNA雙鏈斷裂即可將胞苷轉化為胸腺嘧啶（C轉化為T），在家蠶中使用BE3作為敲除工具，通過堿基編輯誘導外源和內源基因突變的效率高達66.2%，為節肢動物中進行單堿基和多堿基編輯提供更好的工具。

3 小結和展望

CRISPR/Cas9系統作為新興的基因工程編輯工具得到了廣泛的關注，從目前的研究成果可知，在節肢動物中，模式生物家蠶和果蠅為CRISPR/Cas9的技術主要研究物種，研究的基因也較為廣泛，技術多且相對成熟，并且昆蟲綱物種的占比很大，研究類群已經擴展到5個目10余科。相較于昆蟲綱，甲殼綱類群在CRISPR/Cas9技術的應用相對較少，甲殼綱中包含了克氏原螯蝦、南美白對蝦、中華絨螯蟹、三疣梭子蟹等眾多經濟物種，生長、繁殖、病害防治通路中基因的研究有待深入，由于其與昆蟲綱同屬節肢動物門，所以昆蟲綱模式生物的應用技術可以為甲殼動物提供參考，例如在伊蚊中的卵黃蛋白原介導法可以為甲殼動物基因編輯目的基因的導入提供參考。在未來的幾年，CRISPR/Cas9系統將作為新興的基因編輯系統在節肢動物中取得更多的突破和進展，為人類進一步了解基因、利用基因功能奠定基礎。

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