探討新發T1DM并DKA兒童免疫功能狀態分析

周斌，楊玉，劉志強，謝理玲，楊利，徐晗

（江西省兒童醫院，南昌醫學院附屬兒童醫院1.內分泌遺傳代謝科；2.檢驗科；3.兒內科，南昌 330006；4.南昌大學江西醫學院醫學部，南昌 330000）

兒童1型糖尿病 (Type 1Diabetes Mellitus，T1DM)是兒童期最常見的慢性疾病之一，其發病率有逐年增加趨勢，已成為全球最重要的公共衛生問題之一。2021年國際糖尿病聯合會IDF發布了第十版《糖尿病地圖》顯示全球約有261萬年輕T1DM患者（<20歲），其數量為2015年的4倍[1]。T1DM是一種慢性免疫介導性疾病，是由于產生胰島素的胰島β細胞遭到破壞引起胰島素缺乏而導致，但其具體發病機制尚未完全闡明[2]。尤其是對于新發T1DM合并DKA患者的免疫狀態的臨床研究尚不多。因此，本研究通過觀察新診斷的T1DM合并DKA患者體液免疫、炎癥細胞因子及淋巴細胞亞群水平，探討其免疫功能狀態變化，為其進一步的診療提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年01月至2022年1月江西省兒童醫院收治的40例新發T1DM合并DKA患兒為觀察組，其中男16例，女24例，平均年齡8.9歲。入組標準：根據世界衛生組織（WHO）指南及中國共識中的T1DM診斷標準[3-4]，并且排除器質性疾病，如心臟、肝臟、腎臟及結締組織疾病者等情況。DKA的診斷標準采用2020年中華醫學會兒科學分會內分泌遺傳代謝學組發布的最新的兒童DKA診療標準[4]：符合糖尿病診斷標準者，血酮體或尿酮體陽性，同時血氣分析PH值＜7.3或者HCO3-＜15 mmol/L者納入觀察組。本研究經醫院倫理委員會批準(SKJP220202151)，并得到所有受試者家屬知情同意。同時選擇同期來我院兒?？企w檢的健康兒童20例作為對照組，其中男8例，女12例，平均年齡8.8歲。兩組兒童的性別、年齡比較差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 實驗室檢查 觀察組與對照組兒童均抽取清晨空腹外周靜脈血5ml.(1)通過免疫比濁法使用全自動生化分析儀檢測兩組兒童的外周血中的免疫球蛋白（IgM、IgE、IgA、IgG）的濃度。儀器及試劑使用FACS CantoⅡ流式細胞儀（美國BD公司），TD5AWS離心機，美國賽默飛酶標儀，洗板機（安圖實驗儀器有限公司），恒溫孵育箱，PE anti-human TCRγδ（，Alexa Fluor488偶聯anti-human IL-17A McAb，PerCP anti-human CD3、CD8、CD4、CD16、CD56、CD19 McAb，Human IL-1B、IL2R、IL6、IL8、IL10、IL17、TNFα、IFN-γELISA Kit。留取靜脈血1ml放入普通管采集、離心并分離后得到血清，放-80℃冰箱保存后，采用酶聯免疫吸附法檢測血清IL-1B、IL2R、IL6、IL8、IL10、IL17、TNFα、IFN-γ的OD值，并根據試劑盒步驟制作標準曲線，得到公式后，將OD值轉化為的濃度值后匯總進行數據統計。使用淋巴細胞分離液從肝素抗凝的2 mL外周血標本中提取單個核細胞(PBMCs)懸浮液后[5]，再使用胎牛血清培養液將細胞密度調整為2×106/mL，取其中細胞懸液加入豆蔻酰佛波醇乙酯、離子霉素及莫能菌素吹打混勻細胞培養箱內培養5 h。收集培養后細胞于流式上樣管中離心洗滌后再懸浮后待檢測。設立陰性對照并同時設立陽性對照組后，分別加入Per-CP anti-human CD19、CD3、CD8、CD4、CD16、CD56等淋巴細胞表面抗體并染色后進行流式細胞儀檢測；最后得到原始數據導入FACSDiva軟件進行數據分析。

1.3 統計學分析 數據整理核對后采用SPSS 23.0統計軟件進行統計分析。計數資料采用X2檢驗。計量資料采用(±s)表示，Kolmogorov-Smirnov檢驗符合正態性分布，組間采用獨立樣本t檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 觀察組體液免疫水平 觀察組IgA水平高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)；觀察組IgE、IgG、IgM水平與對照組比較無統計學差異(P＞0.05)。見表1。

表1 觀察組與對照組免疫球蛋白水平的比較（±s）

表1 觀察組與對照組免疫球蛋白水平的比較（±s）

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2.2 觀察組細胞因子水平 觀察組IL-1B、IL8、IFNγ水平均高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，觀察組IL2R、IL6、IL10、IL17、TNFα水平與對照組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 觀察組與對照組細胞因子水平的比較（±s）

表2 觀察組與對照組細胞因子水平的比較（±s）

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2.3 觀察組淋巴細胞亞群水平 觀察組B淋巴細胞數、B淋巴細胞百分數、CD4+CD8+雙陽性T淋巴細胞數、CD4+CD8+雙陽性T淋巴細胞百分數、NK細胞數、NK細胞百分數與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，其中觀察組B淋巴細胞數、B淋巴細胞百分數、CD4+CD8+雙陽性T淋巴細胞數、CD4+CD8+雙陽性T淋巴細胞百分數為增高表現，NK細胞數、NK細胞百分數為降低表現；觀察組的總T淋巴細胞數、總T淋巴細胞數百分數、T4淋巴細胞數、T4淋巴細胞數百分數、T8淋巴細胞數、T8淋巴細胞數百分數及T4/T8與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 觀察組與對照組淋巴細胞亞群水平的比較（±s）

表3 觀察組與對照組淋巴細胞亞群水平的比較（±s）

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3 討論

傳統上，1型糖尿?。═1DM）被認為是T細胞介導的自身免疫性疾病。是由于分泌胰島素的胰腺β細胞損傷所致。有研究表明其損傷機制可能與其自反應T細胞的直接相互作用有關。因此，大多數關于1型糖尿?。═1DM）免疫學的研究都集中在T細胞的功能上。這并不奇怪，因為在疾病后期，自反應T細胞介導了產生胰腺β細胞的胰島素破壞[2]。但是，許多研究表明，如抗CD20（利妥昔單抗）療法通過廣泛消耗B細胞治療T1DM的成功，可以延緩非肥胖糖尿?。∟OD）小鼠和新發患者的疾病進展[6-7]。因此表明B細胞免疫耐受性的破壞也是T1DM的主要因素。

本研究結果顯示：兒童新發T1DM并DKA患者體內B淋巴細胞水平及IgA水平顯著增高，提示此類患者體內存在體液免疫的過度激活及功能紊亂。B細胞參與人類T1DM發展的具體機制尚未完全明了。有人認為，與NOD一樣，B細胞通過抗原呈現促進發病機制。HLA II類基因的DR3/4-DQ2/8等位基因對T1D疾病發生的風險最大，表明抗原呈現給CD4 T細胞至關重要[8]。HLA I類等位基因在風險等位基因中排名第二。有趣的是，在新診斷的T1DM患者的胰腺淋巴細胞中，B細胞的頻率僅次于CD8 T細胞[9]。人們很容易猜測，這些B細胞是CD8 T細胞的主要抗原呈遞細胞（Antigen-presenting cells，APC），這在NOD小鼠中已經證明了這一點。這些B細胞必須逃脫正常的沉默機制，并對抗原有反應。這在與對照組相比，T1DM和SLE患者在λ+B細胞中的重組序列（RS）重組都減少了，表明這些自身免疫患者減少了受體編輯[10]。這些研究表明，自身免疫患者在開始RS重新排列時可能具有更高的自反應閾值，可能允許更多的自反應B細胞進入外周。在這方面，最近研究表明，Ptpn22 T1D風險等位基因以B細胞的內在方式發揮作用，允許自反應B細胞進入外周[11]。因此，間接證據表明，在人類T1DM胰島中，抗原反應B細胞有可能逃脫耐受并進入外周，通過向CD4和CD8 T細胞呈現抗原來促進疾病的胰腺定位。

本研究結果顯示：兒童新發T1DM并DKA患者體內IL-1B、IL8、IFN-γ水平顯著性增高，提示此類患者體內存在炎癥相關因子水平的激活。在對一項134名新發的T1DM患兒的2年隨訪研究中發現，與T1DM未緩解的患者相比，緩解者中的IL-8(P=0.042)濃度顯著升高。但也有研究表明，外周血的IL-8水平顯著升高與T1DM代謝控制不佳有關[12]。NOD小鼠作為T1DM的動物模型，通過轉基因雜交技術，得到IL-17和/或IFN-γ雙缺陷的NOD小鼠，發現IL-17/IFN-γ受體雙缺陷NOD小鼠的長期糖尿病發病率明顯下降，但胰島自身炎癥沒有改變，這些結果表明IL-17/Th17參與了胰島炎的發展，并且IL-17和IFN-γ信號傳導可能協同促進NOD小鼠糖尿病的發展[13]。已有多個研究顯示T1DM患者IL-1水平顯著增高，并有IL1受體拮抗劑的治療，如糖尿病行動 (AIDA)和TrialNet Canakinumab(TN-14)試驗中的抗白介素-1治療或者卡那單抗的治療，盡管治療改善T1DM患者炎癥因子水平，但是并不能改善C肽釋放試驗的C肽水平[14]。因此，T1DM存在細胞炎癥因子水平紊亂，但其機制有待進一步研究。

NK細胞（natural killer cell，NK）是一種不表達T細胞（CD3)和B細胞（CD19）的大顆粒淋巴細胞，廣泛分布于外周各組織器官及血液循環系統，無須抗原的預先刺激與活化即可直接激活并通過分泌細胞因子及趨化因子發揮免疫調節功能，因此在機體的免疫調節、抗感染及抗腫瘤等多方面有著不可或缺的作用[15]。雖然有研究在動物模型和糖尿病患者發現NK細胞與T1DM的發病相關，但并無或益或損的定論。且在臨床T1DM患者中，外周血NK細胞活性和數量的變化研究也無最終的結論。臨床NK細胞研究未能深達胰腺的病理與其相互驗證，動物實驗研究亦未能完全模擬人體的病理狀態[16]。本研究顯示，T1DM合并DKA組的NK細胞數量及百分比均有統計學意義上的減少。通過已有的數據及文獻線索推導，T1DM患者外周血NK細胞的降低可能與NK細胞聚集在胰腺或淋巴結中的數量增加有關[17]。其次，動物中的NK細胞功能實驗研究中亦發現，NK細胞可能下調IFN-γ分泌并同時下調自身反應性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，從而達到保護T1DM患者，減輕其自身免疫反應[18，19]。這個機制恰好也可以解釋本研究NK細胞降低與IFN-γ增高這兩個結果的聯系。

T淋巴細胞的分化，根據CD4和CD8的表達，可以將其分為雙陰性（double-negative，DN）、雙陽性（double-positive，DP）和單陽性（single positive，SP）三個主要階段[20]。DN細胞通過“β-選擇”轉化為DP細胞，DP再通過陽性選擇（positive selection）分別與MHC I類分子結合則轉化為CD4-CD8+的單陽性T細胞，與MHCⅡ類分子結合則轉化為CD4+CD8-的單陽性T細胞。其意義在于使DP細胞分化為具有MHC限制性的SP細胞達到免疫作用保護機體。最后不能結合的SP細胞通過陰性選擇（negative selection）發育為成熟T細胞進入外周免疫器官，清除自身反應性T細胞，從而避免發生如T1DM類的自身免疫性疾病[21-22]。本研究為新發T1DM合并DKA患者，其存在T淋巴細胞分化的不暢，但T4淋巴細胞、T8淋巴細胞無顯著性改變，其CD4+CD8+雙陽性T淋巴細胞數增高可能與T1DM處于早期階段有關，其后續變化仍有待進一步研究。

綜上所述，兒童新發T1DM合并DKA患者存在體液免疫功能異常，B細胞數量及IgA的增高，并且兒童新發T1DM并DKA患者體內多種炎癥因子水平增高，存在CD4+CD8+雙陽性T淋巴細胞數增高及NK細胞的降低，提示兒童新發T1DM并DKA患者存在B淋巴細胞與T淋巴細胞的雙重功能異常，淋巴細胞亞群功能紊亂可能為導致兒童T1DM的關鍵病因之一。