NLRC3低表達對人肺正常上皮細胞BEAS-2b侵襲遷移的影響

李杰，劉裬，黃鈾新，盧洪飛，羅耀玲

（1.贛南醫學院第一附屬醫院；2.贛南醫學院，贛州 341000）

肺癌（lung cancer）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其病死率占惡性腫瘤的第一位，被認為是對人類生命和健康威脅最大的腫瘤[1]。盡管現在肺癌在診斷、分期和治療方法上有了很大進步，前景并沒大幅度改變，在過去的十年里總的5年生存率只有輕微的增加（從15.7%到17.4%）[2]。NLRC3是NLR家族一員，它能夠抑制NF-κB控制的主要炎性通路[3-5]。近年來研究發現，NLRC3有潛在的抑癌作用[6-8]，有望成為人類癌癥的預防和治療的新靶點。課題組前期研究發現NLRC3在肺癌組織中的表達明顯低于癌旁組織。該課題進一步從細胞和分子水平研究NLRC3與肺癌發生發展的關系，通過小RNA干擾技術，使NLRC3在BEAS-2b細胞內低表達，觀察低表達NLRC3對細胞侵襲和轉移的影響和初步機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺正常上皮細胞株BEAS-2b細胞購自中科院上海細胞生物研究所細胞庫；RPMI-1640培養基、胎牛血清（GIBCO）；青鏈霉素溶液（索萊寶）；Lipofectamine 2000；RIPA裂解液（上海碧云天）；TRIZOL（Invitrogen）；熒光定量PCR試劑盒（bio-rad）；Matrigel（BD）；Transwell小室（costa）；Ecadherin、MMP-2、MMP-9抗體購自Abcam公司，β-actin一抗及相關二抗購自中杉金橋公司；干擾片段si NLRC3、陰性對照序列（siNC）由生工生物（上海）股份有限公司設計合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人肺正常上皮細胞BEAS-2b培養于RPMI-1640培養液（含10%胎牛血清和1%青鏈霉素溶液）；于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養。細胞貼壁生長覆蓋達80-90%左右時將細胞進行傳代培養。后續實驗所用細胞均是取處于對數生長期的細胞，活細胞數達95%以上。

1.2.2 BEAS-2b細胞的si RNA轉染方法的確定 取對數生長期的BEAS-2b細胞，胰酶消化、計數，按1.5×105cells/孔來接種于6孔培養板，每孔加入2mL完全培養基。待融合度達50%左右進行轉染，將LipofectamineTM2000與熒光FAM標記的陰性siRNA片段（FAM-siNC）按照不同比例進行轉染，轉染4 h后熒光顯微鏡下觀察轉染效率，以確定最佳轉染方法（參照siRNA轉染說明書進行）。

1.2.3 熒光定量PCR驗證干擾效果 轉染方法同前。實驗分為3組：未轉染組（UT）、siNC組、siNLRC3組，每組做2個平行孔。未轉染組用等量PBS代替轉染試劑，轉染4 h后更換成完全培養基繼續培養24 h，然后用Trizol提取每孔總RNA，逆轉錄cDNA后進行熒光定量PCR：NLRC3上游引物：5” -GACATGAAGGCGTTTGGTGT-3” ，下游引物：5” -GCCATAGTAATACGCGGCTG-3” ，長度為153bp；內參β-actin上游引物：5” -TATCCAGGCTGTGCTATCCC-3” ，下 游 引 物：5” -CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3” ，長度為320bp。qRT-PCR條件為：94℃預變性10min；94℃變性15s，60℃退火30s并收集熒光，共40個循環。數據采用相對定量法，以2-△△Ct來進行分析，△Ct=Ct目的-Ct內參，△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組。

1.2.4 Transwell檢測低表達NLRC3對BEAS-2b遷移能力的影響 細胞分組、接種及轉染方法同前，轉染4 h后更換成完全培養基繼續培養24 h。然后收集各組的細胞，計數，用含0.1%BSA的無血清培養基重懸，調節細胞濃度為1×106個/mL。吸取各組細胞懸液200μL加入水化后的Transwell小室中，再通過間隙向下腔加入600μL含5%FBS的培養基，將培養板置于37℃、5%CO2培養箱繼續培養24h；隨后取出Transwell小室，用無菌棉簽擦去小室中的細胞，PBS洗3遍再放回原孔中，下腔加入60μL 5 g/L的MTT，繼續培養4 h后，棄上清，加DMSO 600μL，振蕩10min充分溶解結晶，測A570nm值。

1.2.5 Matrigel檢測低表達NLRC3對BEAS-2b侵襲能力的影響按遷移實驗方法分組及轉染細胞。將基質膠Matrigel進行1:8稀釋，取80μL Matrigel包被Transwell小室，置于培養箱內2 h使Matrigel聚集成凝膠。將轉染24 h的BEAS-2b細胞，消化、離心收集細胞，用0.1%BSA無血清培養基重懸，計數，調整細胞密度為1×106個/mL，每組細胞懸液分別取200μL接種到小室，另將600μL含10%FBS的1640培養液加到下室；繼續常規培養24 h。待培養結束后取出Transwell小室，無菌棉簽拭去小室內未發生侵襲轉移的細胞并用PBS洗滌3遍，甲醇固定20 min，0.1%結晶紫溶液染色15 min，PBS緩沖液輕輕洗3次。顯微鏡下隨機取5個視野計數侵襲轉移細胞數量，重復3次取均數。

1.2.6 Western blot檢測低表達NLRC3對E-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響 按遷移實驗方法分組及轉染細胞。轉染48h后棄上清，并用PBS洗滌2遍，6孔板中每孔加入500μL蛋白裂解液，置冰上作用30min，期間用移液器反復吹打，以便細胞充分裂解。然后將裂解液全部轉移到1.5 mL離心管中，以4℃12000 rpm離心5 min，上清液即為含總蛋白的溶液。蛋白定量（以便統一上樣量）后，煮沸，上樣（總蛋白約30μg）；然后經電泳、切膠、轉膜、封閉、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜等過程。最后用ECL發光并在bio-rad凝膠成像儀上成像，并對條帶進行灰度值分析。

1.3 統計學分析 運用SPSS18.0軟件對數據進行統計分析，結果以（±s）表示；多組數據間的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，方差不齊采用Tamhanes” T2(M)。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 熒光顯微鏡篩選轉染效率FAM-siNC轉染4h后于熒光顯微鏡下觀察轉染效果。結果比例為100 pmol∶5μL組的細胞在熒光鏡下激發出綠色熒光的細胞約占觀察視野下細胞總數的90%以上，且細胞生長狀態良好，后續實驗均以此轉染比例進行細胞轉染。結果見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察轉染效果Figure 1 Transfection effect under fluorescent microscope

2.2 熒光定量PCR檢測干擾效果 熒光定量PCR結果顯示：與未轉染組（UT）比較，siNC組NLRC3基因表達水平略微降低，無統計學意義（P＞0.05）；siNLRC3組NLRC3基因表達水平顯著降低（P＜0.01）。siNLRC3干擾片段干擾效率為77%（相對于陰性片段轉染組siNC）。見表1。

表1 s i NLRC3片段干擾效率（x±s，n=3）Ta b l e 1 s i NLRC3 f r a g me n t i n t e r f e r e n c e e f f i c i e n c y

2.3 NLRC3低表達后對BEAS-2b細胞遷移能力的變化Transwell遷移實驗結果表明，siNLRC3低表達組穿過膜的細胞數比未轉染組UT和陰性干擾組siNC明顯增多（P<0.05）。結果見表2和圖4。

表2 NLRC3低表達后對BEAS-2B細胞遷移能力的影響（x±s，n=3）Table2 The Effectsof silencing NLRC3 on migration of BEAS-2b

2.4 NLRC3低表達后對BEAS-2b細胞侵襲能力的影響Matrigel基質膠檢測BEAS-2b細胞侵襲能力變化，鏡下觀察拍照（10×）見圖5A。計數穿膜細胞數：UT組（266.33±15.63）、si NC組（296.0±27.22）、siNLRC3組（436.33±31.01）。統計分析顯示：與UT組和siNC組相比，siNLRC3組穿過基質膠的細胞數量明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.05），如圖5B所示。

2.5 Western blot檢測低表達NLRC3對E-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，與未轉染組（UT）和陰性轉染組（si NC）相比，NLRC3低表達組（si NLRC3）中E-cadherin蛋白表達水平下調（P<0.01），MMP-2、MMP-9蛋白表達水平上調（P<0.05）。結果如圖6所示。

3 討論

圖2 NLRC3對BEAS-2B細胞遷移能力的影響Figure 2 The effect of NLRC3 on the migration ability of BEAS-2b cells.＊P＜0.05 compared with UT group.

圖3 NLRC3表達降低后對BEAS-2B細胞侵襲能力的影響Figure 3 Effect of reduced expression of NLRC3 on the invasive ability of BEAS-2B cells.P＜0.05 compared with UT group(n=3).

圖4 NLRC3表達降低后對E-caherin、mmp-2、mmp-9蛋白表達水平的影響Figure 4 Effect of NLRC3 expression on the expression levels of E-caherin，mmp-2，and mmp-9 proteins.＊P＜0.05、#P＜0.01 compared with UT group（n=3）.

NLRC3(又稱CLR16.2，NOD3)是2005年才鑒定出來的、屬于NLR家族中的一員[9]。2012年Schneider等首次發現NLRC3的特殊抗炎癥作用，隨后的研究進一步證實它具有負調控固有免疫應答的作用[3]。直至2015年才首次發現NLRC3在腫瘤發生中的重要作用[6]。Liu R等研究發現NLRC3在臨床結腸癌組織中的表達量顯著低于健康組織[10]。Karki等[6]課題組研究發現NLRC3-/-小鼠易患結腸炎和結直腸癌，研究發現NLRC3可通過抑制PI3K-mTOR信號通路的激活而抑制結腸癌的發生。禚映辰等[11]研究發現NLRC3在肺腺癌和肺鱗癌中的表達與正常組織相比顯著降低，NLRC3的表達促進了免疫細胞的浸潤。課題組前期在臨床標本分析中發現NLRC3在肺癌中表達顯著低于癌旁組織。為進一步證明NLRC3作用及功能，實驗選用上皮肺正常細胞株BEAS-2b為細胞模型，通過轉染干擾片段siNLRC3以干擾NLRC3的表達，檢測NLRC3低表達后對細胞侵襲和遷移的影響。實驗首先設計合成NLRC3的小干擾片段siNLRC3，并通過熒光定量PCR檢測干擾效果，結果表明siNLRC3片段干擾效率為77%，說明干擾有效。

腫瘤的侵襲轉移是腫瘤惡性進展的重要因素[12]。NLRC3基因與侵襲轉移是否有關聯呢？利用Transwell實驗進行驗證，在Transwell遷移實驗中，因細胞穿過Transwell小室的細胞相對較多且分布不均勻，故傳統顯微鏡拍照計數法誤差相對較大；本實驗改進方法使檢測結果誤差較小，即利用穿過小室的細胞（均是活細胞）使MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臢，DMSO溶解甲瓚，并在570nm處有最大光吸收。根據測得的吸光度值間接反映穿過小室的細胞數量。Transwell遷移實驗結果表明siNLRC3低表達后穿過小室進入下室的細胞明顯增多，說明細胞的遷移能力增加。Matrigel基質膠檢測結果表明細胞的侵襲能力增強。該結果與程樂達等[13]研究結果一致。

腫瘤的侵襲轉移是腫瘤細胞與宿主細胞之間相互作用的連續過程，該過程是復雜多步驟的[14]。首先是腫瘤細胞降低粘附力，才能從腫瘤母體脫落；目前認為鈣粘蛋白（E-cadherin）與腫瘤細胞粘附力降低關系最密切的，其表達降低或缺失常與侵襲轉移有重要聯系。本實驗結果表明降低NLRC3表達后，E-cadherin蛋白表達降低（P<0.05），提示細胞粘附能力下降，利于細胞的侵襲遷移。其次是細胞外基質和基底膜的降解，這是腫瘤侵襲轉移的一關鍵環節，基質金屬蛋白酶是目前已知能降解細胞外基質的唯一酶類[15]。MMP-2（又名明膠酶A）和MMP-9（又名明膠酶B），可降解IV型膠原和明膠基質；這兩種酶與腫瘤擴散和侵襲強度相關[16-17]。蛋白檢測結果表明NLRC3低表達后MMP-2、MMP-9蛋白表達水平上調，可降解細胞外基質，利于細胞的侵襲轉移。

綜上，NLRC3基因低表達后可引起E-cadherin蛋白表達降低，而MMP-2、MMP-9蛋白表達升高，促進BEAS-2b細胞的侵襲和轉移。