2種微米級聚苯乙烯顆粒對菘藍幼苗生長及土壤群落結構的影響

楊雅杰，褚玲瓏，宋新山，趙曉祥

東華大學環境科學與工程學院，上海 201620

微塑料(microplastics)是指粒徑<5 mm的塑料顆粒和碎片，目前對微塑料的研究已逐步從海洋環境轉向土壤環境[1]，Boyle和?rmeci[2]的研究表明陸地中微塑料的聚集量有可能達到海洋中的4倍～23倍，微塑料難降解會在土壤中長期存在，此外還會釋放增塑劑等污染物[3]，微塑料對土壤微生物的運輸、代謝等均有影響[4-5]。尤其是微塑料可以進入食物鏈[6]，從而對作物和人體健康產生威脅。塑料地膜覆蓋和污泥的土地利用是土壤中微塑料最主要的兩大來源[7]。聚苯乙烯被廣泛應用于各行各業，但其殘余價值低，不易循環再生，會對環境以及其中的動植物和微生物造成極大的影響[8]。

納米塑料已被證明可以穿透植物細胞壁[9]，每種植物對微塑料的吸收取決于多種因素，如根體積、密度和表面積，木質部體積和表面積、汁液酸堿度、蒸騰作用、細胞質和液泡的酸堿度[10-11]。目前一些與微塑料尺寸、形狀和表面官能團相似的工程碳質納米顆粒的研究已經在植物中開展[12]，研究表明微塑料可能是通過胞間連絲的內吞作用、離子轉運通道、載體蛋白或水通道蛋白以及土壤碳[13]或根際分泌物的調節進入植物體內[9, 14]。菘藍是十字花科草本植物，俗稱“板藍根”，有很好的清熱解毒功效，被廣泛使用在醫療領域。目前關于聚苯乙烯納米塑料對菘藍的影響探究較少。本研究擬通過盆栽實驗研究聚苯乙烯微塑料(PS-NPs)對菘藍幼苗的生長特性、生理指標的影響，及土培植物根際土壤微生物群落對PS-NPs脅迫的響應。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

供試聚苯乙烯微塑料(PS-NPs)購買自東莞市樟木頭廣弘高分子材料公司，對材料進行掃描電子顯微鏡(SEM)表征，其粒徑分別為(775.90±61.66) nm (S組)與(50.07±1.29) μm (B組)，S組PS-NPs表面較為光滑，B組PS-NPs顆粒表面粗糙程度較高(圖1)。2種粒徑的供試材料都分布均勻，且形貌規則、無雜質，純度較高，故視為純品。實驗前將2種微粒進行超聲處理(33 kHz，1 h)，使其均勻分散在超純水中。

圖1 2種聚苯乙烯微塑料(PS-NPs)掃描電子顯微鏡(SEM)表征圖注：(a) S組PS-NPs(放大×100 k)；(b) B組PS-NPs(放大×5.00 k)；(c). S組PS-NPs(放大×20.00 k)；(d) B組PS-NPs(放大×15.00 k)。Fig. 1 Scanning electron microscope (SEM) characterization images of polystyrene microplastics (PS-NPs)Note: (a) S group PS-NPs (×100 k); (b) B group PS-NPs (×5.00 k); (c) S group PS-NPs (×20.00 k); (d) B group PS-NPs (×15.00 k).

供試菘藍(Isatisindigotica)種子購自安國市萬草同源苗木花卉有限公司，挑選大小均一，顆粒飽滿的種子用體積分數為10%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min后沖洗3～5次，再置于超純水中浸泡30 min，用濾紙吸干表面水份后均勻放置在土樣中，種子埋深約為2 cm，用霍格蘭營養液保持土壤含水量60%左右，模擬室溫條件(26±2) ℃，發芽期間避光培養，發芽后的生長階段采用光譜植物生長燈對植物進行光照(12 h∶12 h；輻射量(30±5) W·m-2)。

1.2 供試土壤

土壤采集于上海市松江區農田的表層土(采樣深度約為20～25 cm)，除去可見植物殘渣后過2 mm篩，采用常規方法[15]測定土壤理化性質，結果如表1所示。

表1 供試土壤理化性質Table 1 Physical and chemical properties of experimental soil

1.3 實驗設計

針對2種粒徑的PS-NPs分別設置4個濃度的污染土壤(10、100、500和1 000 mg·kg-1)(標號為B10、B100、B500、B1000；S10、S100、S500、S1000)，以不添加PS-NPs的土壤為對照(CK)。將處理后的菘藍種子播種在配制好PS-NPs土樣里，對照實驗中將種子固定在不含PS-NPs的土壤中，每組重復3次。

1.3.1 種子發芽實驗

發芽試驗每盆設置300 g土，每盆播種種子50粒，當胚芽均超過2 mm時視為發芽，連續3 d沒有新芽時視為發芽結束。實驗結束后計算種子發芽率。

1.3.2 植株表型實驗

菘藍種子發芽后繼續培養，共暴露70 d，培養結束后將植株從土壤中小心取出，用自來水沖洗后再用去離子水沖洗3次，濾紙擦干后擺放整齊進行拍照，用image J軟件測量不同處理下菘藍的株高，稱量鮮質量，再將新鮮植株置于65 ℃烘箱24 h后取出，稱量質量得到干質量數據。計算各處理下的幼苗含水率和抑制率。

(1)

(2)

1.3.3 指標測定

生長試驗每盆設置500 g土，待菘藍種子長出四片真葉后再暴露14 d收樣。取菘藍葉片用去離子水再沖洗3次后用濾紙拭干表面水份，剩余葉片置于-80 ℃冰箱保存待測。

用電導儀測定外滲液的電解質含量，以表征脅迫對植物細胞膜的傷害?？扇苄缘鞍诇y定用考馬斯亮藍G-250染色法[16]、超氧陰離子含量測定參考高俊鳳[16]等的方法，丙二醛(MDA)含量測定用硫代巴比妥酸法[17]。葉片抗氧化酶活性測定[18]中，SOD活性測定用氮藍四唑法，POD活性測定用愈創木酚分光光度法，CAT活性測定用高錳酸鉀滴定法。

分別取PS-NPs處理下的土壤(S100、S1000和B100、B1000)及不添加塑料微粒的空白組(CK)土壤，委托上海派森諾生物科技有限公司在Illumina平臺對群落DNA片段進行二代雙端(Paired-end)測序，測序引物為F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA；R: TCGGACTACHVGGGTWTCTAAT，測序區域為16S_V3V4，選用Silva_132數據庫，原始數據以FASTQ格式保存，進行DADA2序列去噪和Vsearch聚類，獲得OTU代表序列后對其長度分布進行統計，再進行物種分類學注釋。

1.3.4 數據統計分析

所有試驗數據均進行單因素方差分析，并用誤差棒表示標準誤差，用Microsoft Excel和SPSS13.0進行處理，用Origin 2018作圖，圖中所示數據均為3組平行實驗的平均值。

2 結果(Results)

2.1 不同濃度聚苯乙烯對菘藍種子發芽率和生長表型的影響

2.1.1 不同濃度聚苯乙烯對菘藍種子發芽率的影響

種子萌發是指種子從吸脹作用開始的一系列的生理過程，了解種子的萌發情況對播種后早出苗、出全苗極為重要。在為期25 d的發芽過程里，2種PS-NPs添加下菘藍種子的發芽率如圖2所示?？梢奝S-NPs對菘藍種子的發芽有顯著促進作用，10 mg·kg-1B組PS-NPs對發芽的促進作用最明顯，其發芽率比CK高約30.00%。1 000 mg·kg-1脅迫濃度下S組、B組之間對發芽的促進無顯著差異，約比CK高出20.00%。

圖2 PS-NPs對菘藍種子發芽率的影響注：字母不同表示差異顯著，P<0.05。Fig. 2 The germination rate of Isatis indigotica seeds treated with different particle sizes of PS-NPsNote: Different letters indicate significant differences, P<0.05.

實驗中菘藍種子日發芽情況如圖3所示，將發芽過程分為初(3～9 d)、中(11～19 d)、后(19～25 d)3個時期。與CK相比，S處理中發芽初期1 000 mg·kg-1的促進作用明顯，中期10 mg·kg-1的處理組發芽數最多；B處理組中發芽初期PS-NPs對發芽率影響不明顯，中后期10、100、1 000 mg·kg-1處理下種子的發芽數接近，均高于CK組。

圖3 不同PS-NPs處理下菘藍種子日發芽情況注：(a)S組PS-NPs處理下菘藍的日發芽數；(b)B組PS-NPs處理下菘藍的日發芽數；字母不同表示差異顯著，P<0.05。Fig. 3 Daily germination of Isatis indigotica seeds treated with different PS-NPs Note: (a) Daily germination numbers of Isatis indigotica with treat-S PS-NPs; (b) Daily germination numbers of Isatis indigotica with treat-B PS-NPs; different letters indicate significant differences, P<0.05.

2.1.2 不同濃度聚苯乙烯對菘藍植株株高、質量和含水率的影響

株高和鮮質量、干質量是植物學形態調查的基本要素。如表2所示，不同濃度S處理均促進了幼苗株高、鮮質量和干質量，隨著脅迫濃度的升高，促進效果減弱；如表3所示，100、500和1 000 mg·kg-1的B處理抑制了幼苗株高，但1 000 mg·kg-1處理對鮮質量的促進率低于500 mg·kg-1；2種PS-NPs對含水率都幾乎無影響。

表2 S組PS-NPs處理對菘藍幼苗生物量的影響Table 2 Effects of S group PS-NPs treatments on biomass of Isatis indigotica seedlings

表3 B組PS-NPs處理對菘藍幼苗生物量的影響Table 3 Effects of B group PS-NPs treatments on biomass of Isatis indigotica seedlings

2.2 不同濃度聚苯乙烯對菘藍幼苗抗逆性的影響

2.2.1 不同濃度聚苯乙烯對菘藍葉片細胞膜傷害率的影響

由圖4可知，處理組植株葉片細胞膜傷害率均顯著高于CK，且S處理對菘藍葉片細胞膜的傷害率均大于B處理，10、100和500 mg·kg-1的S組PS-NPs比B組對細胞膜的傷害率分別高出11.48%、5.55%和5.24%，此外隨著濃度的增加微塑料對細胞膜的傷害率逐步增加，當PS-NPs的濃度為1 000 mg·kg-1時，S組、B組對細胞膜的傷害率達到最大，分別為76.97%和76.30%，約為CK的2.53倍和2.51倍。

圖4 PS-NPs對菘藍葉片細胞膜傷害率的影響注：字母不同表示差異顯著，P<0.05。Fig. 4 Effects of PS-NPs on cell membrane damage rate of Isatis indigotica leavesNote: Different letters indicate significant differences, P<0.05.

2.2.2 不同濃度聚苯乙烯對菘藍葉片可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是重要的調節物質和營養物質，其積累可以提高細胞的保水能力，對細胞的生命物質及生物膜起到保護作用。如圖5所示，10、100和500 mg·kg-1不同PS-NPs脅迫下的菘藍葉片可溶性蛋白含量與CK無顯著差異；PS-NPs濃度為1 000 mg·kg-1時S處理可溶性蛋白含量為2.54 mg·g-1，B處理為2.90 mg·g-1，分別比CK高出29.81%和48.25%。

圖5 PS-NPs對菘藍葉片可溶性蛋白含量的影響注：字母不同表示差異顯著，P<0.05。Fig. 5 Effects of PS-NPs on soluble protein content of Isatis indigotica leavesNote: Different letters indicate significant differences, P<0.05.

2.2.3 不同濃度聚苯乙烯對菘藍葉片丙二醛含量的影響

如圖6所示，與CK相比PS-NPs脅迫下菘藍葉片的MDA含量顯著升高，并與脅迫濃度呈正相關，在0～500 mg·kg-1濃度范圍內S組顯著高于B組，1 000 mg·kg-1時S組、B組MDA含量無顯著差異，并且可以看出B組植株在500～1 000 mg·kg-1的脅迫濃度范圍里MDA含量由0.22 mmol·g-1增加至0.39 mmol·g-1，此階段升高了76.16%，1 000 mg·kg-1下MDA含量約是CK的7.05倍。

圖6 PS-NPs對菘藍葉片的丙二醛(MDA)含量的影響注：字母不同表示差異顯著，P<0.05。Fig. 6 Effects of PS-NPs on malondialdehyde (MDA) content of Isatis indigotica leavesNote: Different letters indicate significant differences, P<0.05.

2.2.4 不同濃度聚苯乙烯對菘藍葉片抗氧化酶活性的影響

如圖7所示，處理組菘藍葉片中SOD、CAT、POD活性均高于CK。10 mg·kg-1、100 mg·kg-1下S組、B組的SOD活性無顯著性差異，CAT、POD活性S組顯著高于B組；500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1下B組SOD、POD活性分別約為S組的1.36倍、1.47倍和3.59倍、4.55倍。S組POD活性在試驗期間上下波動，1 000 mg·kg-1下達到最大，約為CK的3.57倍；B組CAT活性在500～1 000 mg·kg-1從136.13 U·g-1·min-1躍增至289.08 U·g-1·min-1，增長了1.12倍。

圖7 PS-NPs對菘藍葉片抗氧化酶活性的影響注：字母不同表示差異顯著，P<0.05。Fig. 7 Effects of PS-NPs on antioxidant enzymes activity of Isatis indigotica leavesNote: Different letters indicate significant differences, P<0.05.

2.3 不同濃度聚苯乙烯對菘藍根際土壤細菌群落結構的影響

2.3.1 不同濃度聚苯乙烯對菘藍根際土壤細菌群落多樣性指數的影響

如表4所示，對PS-NPs處理后的植物根系土壤微生物群落多樣性進行分析，Shannon指數、Simpson指數反映樣品中微生物多樣性，Chao 1指數反映樣品群落豐富度，Pielou指數反映樣品物種均勻度。處理組的Shannon指數均高于CK，說明PS-NPs的添加可以增加樣品微生物群落的多樣性。脅迫濃度為1 000 mg·kg-1時，B組樣品微生物群落Shannon指數、Pielou指數和Chao 1指數分別高出S組7.52%、3.42%和73.06%，而脅迫濃度為100 mg·kg-1時S組分別高出B組17.94%(Shannon指數)、0.11%(Pielou指數)和67.89%(Chao1指數)。

表4 樣品生物多樣性指數Table 4 Sample biodiversity index

如圖8所示，CK組樣品中有2 949個OTUs，S組樣品中有5 950個OTUs，B組樣品中有8 341個OTUs。3個樣品共有OTUs數為1 476個，分別占各自OTUs總數的50.05%(CK)、24.81%(S組)和17.70%(B組)，可見B組OTUs數目較多且有更多特有的OTUs。由圖9可知，處理組樣品中的物種豐富度高于CK，3個樣品稀釋曲線隨序列數的增加均趨于平緩，表明測序數據量合理，測序結果真實可信。

圖8 樣品中OTUs分布Venn圖Fig. 8 Venn diagram on OTUs distribution in sample

圖9 樣品中OTUs的稀釋曲線Fig. 9 Rarefaction curve of OTUs in sample

2.3.2 不同濃度聚苯乙烯對菘藍根際土壤細菌群落組成的影響

如圖10所示，根據物種注釋結果，不同微塑料添加下供試土樣門水平上相對豐度大于1%的有8個，分別為放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、Patescibacteria和Latescibacteria。CK組中放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門相對豐度分別為42.78%、27.69%、13.64%、6.73%；與CK相比，S100、S1000、B1000處理中放線菌門豐度分別降低了15.30%、21.87%、21.21%；處理組變形菌門豐度均高于CK，分別提高了31.80%(S100)、25.73%(S1000)、12.64%(B100)、21.68%(B1000)。

圖10 根際土壤微生物門水平物種相對豐度Fig. 10 Relative abundance of horizontal species of rhizosphere soil bacterial flora

3 討論(Discussion)

3.1 不同濃度聚苯乙烯對菘藍種子發芽率和生長表型的影響

當PS-NPs添加量較高時激發了種皮對種子的保護機制，在胚胎與周圍環境之間形成了屏障，故1 000 mg·kg-1下S組與B組對發芽率的促進作用無顯著差異。

處理組植物的形態學指標比CK均有增加，也有研究表明PS-NPs并不會對小麥的根系生長產生抑制[19]，徐榮樂和海熱提[20]在塑料地膜對小麥種子萌發影響的研究中發現，相同濃度下厚度為0.03 mm的地膜對小麥芽長的影響大于0.08 mm地膜，這也和本實驗研究結果一致。

3.2 不同濃度聚苯乙烯對菘藍葉片細胞膜傷害率的影響

本研究中PS-NPs對菘藍葉片細胞膜的傷害率均顯著高于CK，有研究表明10 mg·L-1的PS-NPs會顯著增加小麥葉片中的電解質外滲率[19]。有研究表明較小粒徑的微塑料更容易對細胞膜產生傷害，100 nm和300 nm PS-NPs微球中的大分子鍵在植物莖中發生了斷裂[21]，小粒徑PS-NPs運輸至葉片時已經是小分子鍵，內聚力降低，對葉片細胞膜的傷害程度加深[22]。當脅迫濃度為1 000 mg·kg-1時，過多的PS-NPs已經對葉片表皮、葉肉和葉脈的正常生理過程均產生了影響，此時不同粒徑下PS-NPs對葉片細胞膜傷害率無顯著差異。

3.3 不同濃度聚苯乙烯對菘藍葉片抗氧化能力的影響

可溶性蛋白是細胞滲透調節物質，本研究中由于過氧化物酶起到的保護作用過強，導致處理組可溶性蛋白含量雖幾乎均略高于CK，但無顯著性差異。

植物體內MDA含量的變化可以反映逆境條件下植物細胞膜脫脂化程度和超氧自由基對組織損傷的嚴重程度[23]。本研究中處理組MDA含量顯著高于CK，有研究表明水華微囊藻與蛋白核小球藻細胞內MDA含量在500 mg·L-1納米聚氯乙烯、納米聚丙烯脅迫下顯著升高[24]。此外較小粒徑的PS-NPs會穿透根系進入植物[25]，并在蒸騰作用下通過導管吸收，隨營養物質一起進入可利用部位(根、葉)[26]。同時本實驗中小粒徑PS-NPs表面比大粒徑更為光滑，因此可以更容易地進入植物中引起較嚴重的脂質過氧化。當PS-NPs濃度為1 000 mg·kg-1時，S組、B組的MDA含量無顯著差異，表明此時微塑料粒徑不再是影響MDA含量的主要因素。相比之下，菘藍葉片MDA含量對PS-NPs的敏感性高于可溶性蛋白。

3.4 不同濃度聚苯乙烯對菘藍葉片抗氧化酶的影響

外在脅迫使植物產生更多的活性氧自由基(ROS)，SOD、CAT和POD都是植物體內清除活性氧自由基的保護酶，SOD作為清除ROS的第一道防線可催化超氧化物自由基將其歧化為H2O2和O2，隨后CAT和POD將H2O2歧化為H2O和O2[27-28]，這也可以解釋本實驗中SOD活性均相應地高于相同處理下的CAT和POD活性。

脅迫濃度為10 mg·kg-1和100 mg·kg-1時，S組與B組SOD活性無顯著差異，當脅迫濃度為500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1時，大粒徑的PS-NPs增強了SOD編碼基因的表達[29]，故B組SOD活性高于S組。Jiang等[30]的研究表明蠶豆在聚苯乙烯微塑料的脅迫下其SOD活性增加，并且通過遺傳學證明100 nm的PS-NPs比5 μm的PS-NPs對蠶豆有更強的氧化損傷，這和本次實驗結果一致。

處理組CAT活性均顯著高于CK，有研究表明在塑料微珠對銅綠微囊藻脅迫的1～9 d內，藻細胞CAT活性顯著增高[31]。10 mg·kg-1和100 mg·kg-1濃度下S組CAT、POD活性均大于B組，1 000 mg·kg-1濃度下S組CAT、POD活性小于B組，這與高濃度脅迫下SOD歧化產生的H2O2更多有關。此外1 000 mg·kg-1下S組與B組POD的活性差值小于CAT的活性差值，因為POD是ROS清除同工酶，會通過多種不同的調節機制應對環境壓力，其生物體耐受閾值低于CAT[32]。

Li等[21]研究了100、300、500和700 nm的PS-NPs微粒對黃瓜幼苗的抗氧化酶系統影響，結果表明SOD和CAT的相關基因表達量與顆粒大小呈顯著負相關，這與本實驗結果相反，這由于本實驗中聚苯乙烯微粒粒徑較之更大，材料表面形貌、脅迫濃度均不相同等因素導致。

3.5 不同濃度聚苯乙烯對菘藍根際土壤微生物群落結構的影響

Zhang等[26]在對新疆棉田微生物群落多樣性和組成的研究中發現微塑料存在的土壤中放線菌門和變形菌門豐度最高，這與本實驗得到的結果一致。添加PS-NPs的土壤與CK優勢菌門相同，但豐富度有所變化。與CK相比，添加PS-NPs后土壤中變形菌門、酸桿菌門豐度升高。變形菌門通常生活在較松弛的土壤中，PS-NPs本身具有一定的柔韌性，有利于其與土壤結合，因此影響了土壤容重。此外碳作為PS-NPs的主要成分，其添加也會影響土壤中碳的形態與含量，使變形菌門豐度變高[33]。有研究表明添加聚乙烯微塑料會影響土壤酸堿性，即微塑料的長期存在會使土壤酸化[34]，而酸桿菌門的豐度與pH呈負相關，故本研究中PS-NPs添加組土壤酸桿菌門豐度高于CK。

與CK相比PS-NPs添加使土壤的綠彎菌門豐度降低，研究表明，微塑料會影響土壤含水率和銨態氮含量，而綠彎菌門豐度受此二者影響，故微塑料的添加不利于綠彎菌門生長[35]。

與CK相比100 mg·kg-1PS-NPs降低了擬桿菌門的豐度，1 000 mg·kg-1PS-NPs則增加了其相對豐度，芽單胞菌門有相同的變化特征。因為較高濃度的微塑料提高了土壤中熒光素二乙酸水解酶(FDAse)和酚氧化酶的活性[36]，植物的愈傷反應會使呼吸作用增強并釋放酚類物質，酚類物質可被酚氧化酶氧化為具有提高微生物的自我保護能力的醌類物質[12, 37]。

有研究表明微塑料可以通過直接吸附影響土壤酶活性，從而改變土壤的物理性質和微環境[36]。在本研究中S組材料粒徑更小更容易團聚，團聚體的結合力更大；B組材料排列整齊緊密且表面凹凸不平。此外二者在土壤中不同的降解性能會進一步影響微生物群落結構，但具體的降解性能、降解產物還有待進一步探究。結果顯示100 mg·kg-1濃度下S組群落多樣性大于B組，由圖1可知S組材料的結構比表面積更大，為微生物提供了更多的棲息位點；但當脅迫濃度為1 000 mg·kg-1時B組群落多樣性大于S組，因為高濃度刺激了某些微塑料的微生物降解過程，目前大量研究表明在陸地環境中放線菌門的某些種可以通過合成水解酶來生物降解微塑料。

綜上，在2種粒徑PS-NPs對菘藍的脅迫研究中，脅迫濃度>10 mg·kg-1時B組會抑制幼苗株高，不同濃度下S組、B組對鮮質量均有促進作用；隨著脅迫濃度的增加不同粒徑的PS-NPs對葉片細胞膜的傷害程度趨于一致；不同處理下SOD活性均高于CAT、POD活性，3種酶的活性都與脅迫濃度呈正相關，1 000 mg·kg-1下粒徑對其影響更為顯著。添加PS-NPs的土壤與CK優勢菌門相同但豐度不同，處理組變形菌門、酸桿菌門豐度升高，而綠彎菌門豐度降低，微生物群落豐度與材料表型有關。但聚苯乙烯微塑料在環境中由于降解形成的單體，以及塑料添加劑給植物與土壤帶來的影響還有待進一步研究。