殺蟲劑阿維菌素、伊維菌素對斜生柵藻和大型蚤的毒性作用

陳彥吉，柳川江，宋怡彤，林以詩，徐冬梅

浙江樹人學院生物與環境工程學院，杭州 310015

阿維菌素(avermectin, AVM)是一類具有殺菌、殺蟲、殺螨、殺線蟲活性的十六元大環內酯化合物。作為甲胺磷等高毒農藥的替代品，AVM由于具有殺蟲范圍廣、效果明顯持久且相對安全可靠等優點，順應了現代農業對農藥的要求，在世界范圍內被廣泛應用[1-2]。其衍生物伊維菌素(ivermectin, IVM)對寄生蟲特別是線蟲和節肢動物均有較好的防治效果，被廣泛應用于農業、畜牧業、醫藥行業和水產養殖中的害蟲防治劑[3]。AVM和IVM是高脂溶性的，不論以何種途徑給藥，進入動物體內后殘留時間長且代謝很少，大部分是以原藥的形式經糞尿排出體外[4]。因此，該類藥物除在農業生產和畜禽水產養殖過程中通過直接噴灑進入環境外，還可能隨畜禽類生物的代謝物進入水體環境[5-6]，其對非靶標生物的毒性效應及其生態風險值得關注。該類藥物還可能通過誘導DNA損傷和AMPK/mTOR信號通路介導的自噬產生遺傳毒性和細胞毒性，從而對人類健康構成潛在風險[7]。

大型蚤(Daphniamagna)為甲殼綱的枝角類浮游動物，廣泛分布于淡水水域。它以水環境初級生產者淡水綠藻類為食，同時又是魚和無脊椎捕食動物的天然餌料，是水生態系統中物質循環和能量流動的重要環節[8]。作為靜水生態系統的關鍵屬，大型蚤不僅具有重要的生態意義，而且具有生殖周期短、繁殖迅速、對水體中有害污染物敏感等特點，在水生生態毒理學和環境風險評估中得到了廣泛的應用[9-10]。本研究以水生態初級生產者淡水綠藻和浮游動物大型蚤為模式生物，在考察AVM和IVM對斜生柵藻和大型蚤急性毒性的基礎上，探討2種殺蟲劑對大型蚤生長繁殖等的影響，為評價AVM、IVM對水生態環境的影響及可能的健康風險提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)購自中國科學院水生生物研究所，以水生4號(HB-IV)培養基、人工氣候箱中馴養1個月后進行試驗。大型蚤購自武漢科樂多生物科技有限公司，選用OECD M4培養基作為培養液，實驗室培養4代后，以出生6～24 h的同批幼蚤進行毒性試驗。AVM和IVM原藥購自湖北貓爾沃生物醫藥有限公司，試驗所用其余試劑均為分析純(純度均為99%)，實驗用水為超純水。

將處于對數生長期的斜生柵藻接種到150 mL錐形瓶中，實驗初始藻細胞密度約7.0×105個·mL-1，總體積100 mL。設置AVM和IVM的試驗濃度梯度均為0、20、40、80、160、320和640 mg·L-1。每個試驗濃度組設3次重復，試驗期間保持光暗比12 h∶12 h，光照強度4 500～5 000 lx，培養溫度(24±1) ℃[11]。藥物暴露96 h后用血球計數法計量細胞數量，計算AVM和IVM對藻細胞的生長抑制率。大型蚤急性毒性試驗按照ISO 6341—2012標準試驗方法進行[12]。試驗容器為50 mL燒杯，盛40 mL試驗溶液，每個燒杯中放5只幼蚤，AVM和IVM的大型蚤暴露濃度均設置為0、0.1、0.4、1.6、6.4和25.6 μg·L-1，水溫20～22 °C，光照周期為16 h光照∶8 h黑暗，試驗期間不喂食，每個濃度4組平行，連續暴露48 h后，記錄大型蚤的死亡情況，計算AVM和IVM對大型蚤半數致死濃度(LC50)值。根據急性毒性試驗求得的2種藥物對大型蚤LC50值，慢性試驗的AVM、IVM濃度設置分別為0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 μg·L-1和0.0038、0.0075、0.015、0.03、0.06 μg·L-1，慢性毒性試驗參照楊曉凡等[13]的方法。每個燒杯中放1只幼蚤，每濃度設置10個平行，染毒過程中保證蚤類的生活環境適宜和食物充足，并且每天定時觀察、記錄和分離幼蚤，每3 d更換一次培養液，其余條件與急性毒性試驗相同。

利用Origin 8.0軟件進行斜生柵藻急性毒性劑量效應曲線的擬合，利用SPSS 17.0軟件計算AVM和IVM對大型蚤的LC50值及95%置信區間；通過Duncan法進行組間差異顯著性分析，數據結果采用means±SD的方法。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 AVM和IVM對斜生柵藻的毒性作用

利用非線性最小二乘擬合(NLSF)模塊下的DoseResp模型對斜生柵藻96 h生長抑制結果進行線性擬合，進而求得AVM和IVM對藻生長抑制率的濃度-效應曲線(圖1)。由圖1可知，20～160 mg·L-1的2種農藥暴露下，斜生柵藻的生長抑制曲線變化較為平緩；藥物濃度增至320 mg·L-1后，AVM對藻細胞的生長抑制率顯著增大，并且遠高于相同濃度IVM的抑制率；至最高濃度640 mg·L-1，AVM和IVM對斜生柵藻的抑制率分別達55.73%和41.84%。表明AVM對斜生柵藻的生長抑制作用較IVM更強。

圖1 阿維菌素(AVM)和伊維菌素(IVM)暴露的斜生柵藻急性毒性劑量效應曲線Fig. 1 Dose-response curves of acute toxicity of Scenedesmus obliquus exposed to avermectin (AVM) and ivermectin (IVM)

目前的研究證明，AVM類藥物對植物的毒性作用遠小于非靶標動物。Ti?ler和Er?en[6]通過21 d暴露實驗研究發現AVM對水環境大型蚤的生存和繁殖具有極高的毒性，而淡水綠藻(Scenedesmussubspicatus)對AVM的響應并不敏感，20 mg·L-1的AVM對藻細胞生長抑制率達到100%。本研究640 mg·L-1的AVM和IVM對斜生柵藻的生長抑制率為50%左右，可見2種藥物對淡水綠藻的生長抑制作用并不明顯。但張衛衛等[14]研究發現植物伊樂藻(Elodeanuttallii)對于AVM具有明顯的吸收和富集作用。經AVM淋溶后的土壤淋出液會造成浮萍(LemnaminorL.)葉綠素含量降低[15]。在群落水平上，AVM類藥物短期暴露可顯著影響水體浮游植物群落結構。向主養草魚的池塘中施用AVM 6 d后，水體浮游植物優勢種變化顯著，小型浮游植物種類增多[16]。此外，Macar[17]報道了AVM對洋蔥鱗莖具有細胞毒性和遺傳毒性，表現為經AVM暴露的細胞有絲分裂指數下降、染色體異常，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性和丙二醛含量等氧化應激指示升高。而Muhammad等[18]通過系統分析AVM噴灑水稻后其轉錄組的變化，發現施藥情況下水稻突變的基因數量為0.91%，表明其對水稻生產性能影響不明顯。

2.2 AVM和IVM對大型蚤的急性毒性

由圖2可知2種藥物對大型蚤48 h急性毒性影響，在0.1～6.4 μg·L-1的藥物作用濃度范圍內，IVM對大型蚤的致死作用始終大于AVM，至最高濃度25.6 μg·L-1時，2種藥物暴露的大型蚤死亡率均達到100%。計算得到AVM和IVM 48 h急性毒性LC50值分別為1.43 μg·L-1和0.5 μg·L-1，相應的95%置信區間為0.76～2.74 μg·L-1和0.23～0.96 μg·L-1(表1)。根據化學農藥環境安全評價試驗準則中農藥對大型甲殼類生物急性毒性劃分標準，AVM和IVM對大型蚤均為劇毒(LC50-48h值遠小于0.1 mg·L-1)[19]，且IVM對大型蚤的急性致死作用較AVM更強。

圖2 AVM和IVM對大型蚤的急性致死作用Fig. 2 Acute lethal effects of AVM and IVM on Daphnia magna

表1 AVM和IVM對大型蚤LC50-48h及置信區間Table 1 LC50-48h and confidence interval of AVM and IVM for Daphnia magna

與對植物的毒性影響不同的是，AVM類藥物對水生動物具有強烈的毒性作用[6, 20]。王錫珍和陸宏達[21]采用換液法求得AVM對大型蚤的LC50-48h為0.37 μg·L-1，AVM對供試淡水水生動物的毒性依次為：大型蚤>異育銀鯽魚苗>鰱魚苗>異育銀鯽魚種>食蚊魚>幼蟹>青蝦>圓田螺。IVM對淡水常見橈足類近鄰劍水蚤48 h的LC50值為0.16 μg·L-1[22]。本研究AVM和IVM對大型蚤的LC50-48h值分別為1.43 μg·L-1和0.51 μg·L-1，表明2種藥物對大型蚤的毒性遠大于對淡水綠藻的。

2.3 AVM和IVM對大型蚤生長的影響

大型蚤于不同濃度的AVM中暴露第9天起，最高濃度組(0.16 μg·L-1)的大型蚤開始出現死亡，暴露21 d后，最大濃度組的死亡率達到60%；IVM的0.03 μg·L-1和0.06 μg·L-1暴露組從第7天開始出現死亡，21 d后的0.03 μg·L-1和0.06 μg·L-1暴露組大型蚤死亡率分別達40%和50%。從藥物暴露后存活的各濃度組中隨機選取3組進行體長、繁殖等指標的測定和計算。AVM和IVM暴露21 d的大型蚤體長變化如圖3所示，結合顯著性差異分析結果可見，低濃度0.01～0.04 μg·L-1的AVM暴露下，大型蚤體長稍有降低，與對照組無顯著性差異；0.08 μg·L-1和0.16 μg·L-1濃度組的大型蚤體長分別為對照組的90.8%和78.0%，顯著低于對照。IVM暴露的大型蚤自0.0075 μg·L-1濃度組開始顯著低于對照，此后隨著藥物暴露濃度的增大，大型蚤體長緩慢降低。0.0075～0.06 μg·L-1的IVM暴露組大型蚤體長分別相當于對照值的89.7%、88.2%、87.5% 和84.1%。

圖3 AVM和IVM暴露21 d的大型蚤體長變化Fig. 3 Body length changes of Daphnia magna exposed to AVM and IVM for 21 d

2.4 AVM和IVM對大型蚤繁殖的影響

AVM和IVM暴露21 d后大型蚤生殖指標的變化情況分別如表2和表3所示，包括第一次產卵時間、第一次產卵數等。由表3可知，在整個藥物作用濃度范圍內，大型蚤第一次產卵時間和每只母蚤的胎數與對照組相比均無顯著差異；但第一次產卵數、每只母蚤產幼蚤總數和凈生殖率均隨藥物暴露濃度的升高而降低，自0.02 μg·L-1暴露組開始，以上3個指標均隨著藥物暴露濃度的增大顯著低于對照。相比之下，內稟增長率自最低濃度0.01 μg·L-1暴露組開始即顯著低于對照，此后隨著藥物暴露濃度的增大更加顯著地降低，表明大型蚤的內稟增長率和凈生殖率是對AVM較為敏感的指標[23]。

表2 AVM對大型蚤慢性毒性(生殖影響)Table 2 Chronic toxicity of AVM on reproduction of Daphnia magna

由表3可知IVM對大型蚤的生殖毒性，除第一次產卵時間在整個藥物的作用濃度范圍內與對照組相比均無顯著差異外，其余生殖指標均隨IVM暴露劑量的增大而表現出顯著降低的變化趨勢。其中對IVM最敏感的為幼蚤數/母蚤和凈生殖率，從0.0075 μg·L-1開始即顯著低于對照；內稟增長率則從0.015 μg·L-1開始顯著低于對照。相比之下，第一次產卵數和胎數/母蚤則從0.03 μg·L-1暴露組開始顯著低于對照。

表3 IVM對大型蚤慢性毒性(生殖影響)Table 3 Chronic toxicity of IVM on reproduction of Daphnia magna

生長、繁殖作用等是常被用來評價污染物對大型蚤慢性毒性作用的指標[24]。Lopes等[25]通過試驗觀察到IVM對大型蚤生長、繁殖的最小有作用劑量為0.01 ng·L-1。AVM和IVM對大型蚤的慢性毒性較鉛、鎘等重金屬和毒死蜱、三唑磷、氟蟲腈等農藥[26]、全氟化合物[27]等都更加明顯。本研究發現AVM和IVM對大型蚤具有較明顯的慢性生長抑制和生殖毒性，表現為較高濃度藥物暴露下，大型蚤體長、第一次產卵數、幼蚤數/母蚤、凈生殖率和內稟增長率均顯著降低，尤其以凈生殖率和內稟增長率對藥物更為敏感。這可能是由于AVM影響了大型蚤生理指標及抗氧化能力的結果。Mahmoud[28]以LC50-96h值的1/10暴露尼羅羅非魚后，發現AVM脅迫降低了魚的生長性能、生理、免疫力和抗氧化能力。Huang等[29]研究發現10 μmol·L-1AVM暴露顯著降低中華絨螯蟹血細胞的細胞活力，抑制吞噬活性，降低酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性，并推測活性氧(ROS)的過量產生可能是導致中華絨螯蟹細胞活力和免疫功能下降的主要原因。此外，AVM類藥物對水生動物還具有一定的神經、發育和免疫等毒性。Raftery和Volz[20]發現AVM可逆地抑制斑馬魚早期胚胎的自發運動，認為是藥物與斑馬魚胚胎中氯離子通道門控配體可逆結合，抑制神經傳遞的結果。依據歐盟關于危險物質分類的相關標準，AVM對于水生生物屬劇毒，具有較高的生態環境風險。因此，在水產病害防治中應重視AVM類藥物的合理用藥。

2.5 AVM對大型蚤慢性毒性的顯微鏡觀察

不同濃度AVM暴露21 d后的大型蚤顯微鏡下形態觀察結果如圖4所示。由圖4(a)可知，對照組大型蚤腸道、卵巢和孵育囊中的卵均較清晰；而隨著AVM暴露濃度的增大，大型蚤除體長變小外，卵巢出現腫脹，尤其以孵育囊中的卵變化更為明顯。至高濃度0.04、0.08和0.16 μg·L-1，卵已經模糊不清，表明較高濃度的AVM顯著影響了大型蚤的生長和生殖，這與前述的實驗結果相一致。

圖4 AVM暴露21 d的大型蚤顯微鏡觀察結果注：(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)分別為0、0.01、0.02、0.04、0.08和0.16 μg·L-1的AVM暴露組。Fig. 4 Microscopic observation of Daphnia magna exposed to AVM for 21 dNote: (a), (b), (c), (d), (e) and (f) represent AVM exposure group of 0, 0.01, 0.02, 0.04, 0.08 and 0.16 μg·L-1, respectively.

綜上所述，本研究表明：(1) 最高暴露濃度640 mg·L-1AVM和IVM對斜生柵藻生長抑制率分別為55.73%和41.84%；AVM和IVM對大型蚤的LC50-48h值分別為1.43 μg·L-1和0.51 μg·L-1，表明2種藥物對淡水綠藻的生長抑制作用不大，但對大型蚤均為劇毒；(2) 0.08、0.16 μg·L-1AVM和0.015～0.06 μg·L-1IVM暴露21 d后，大型蚤體長顯著降低；而大型蚤產卵數、凈生殖率和內稟增長率等生殖指標對2種藥物的響應較體長變化更為敏感。