毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露誘導小鼠精原細胞凋亡

潘志輝，席令儀，孫景然，劉偉麗，吳瑾，房彥軍

軍事科學院軍事醫學研究院 環境醫學與作業醫學研究所，天津 300050

現代農業中，使用農藥的種類和數量越來越多。農藥是把“雙刃劍”，它能解放農業生產力、減少農產品產量損失，但濫用農藥會造成環境污染、人畜中毒等嚴重后果，人們通過皮膚接觸、飲食攝入和呼吸暴露于農藥[1]。農藥對生物具有多種毒性，主要包括生殖毒性、內分泌干擾毒性和神經系統毒性等，對人類健康造成嚴重威脅。長期低劑量接觸有機磷農藥會降低男性精子存活率，影響受精能力及精液的染色質結構[2]。

毒死蜱是一種廣譜有機磷農藥，在世界范圍內廣泛使用，其半衰期較長，能夠長時間存在于土壤和水中[3]。毒死蜱可以損傷神經系統、生殖系統和免疫系統等，現有研究表明其可導致雄性大鼠精子數量減少、生存能力降低，睪酮等生殖激素水平明顯降低[4]。長期暴露于毒死蜱會導致各種生殖系統缺陷，比如男性生殖系統功能退化和不育[5]。Vahabi Barzi等[6]的研究表明，毒死蜱損傷小鼠生殖系統，誘導胚胎發育中的細胞凋亡，進而導致流產。毒死蜱暴露后，誘導GC-1細胞活性氧(ROS)水平升高，并導致細胞凋亡[7]。三唑類殺菌劑是一類具有獨特1,2,4-三唑環結構的殺菌劑，在農業生產中應用非常廣泛[8]。苯醚甲環唑作為三唑類中應用廣泛的農藥之一，更易進入環境中造成污染，對人體健康產生威脅。長期暴露于苯醚甲環唑降低海洋青鳉魚下一代的繁殖力和生存力[9]。Li等[10]的研究結果表明，苯醚甲環唑誘導小鼠巨噬細胞核溶解，提高細胞凋亡率。苯醚甲環唑暴露后，顯著降低大鼠睪丸內精子數量，誘導組織結構改變和DNA損傷[11]。此外，苯醚甲環唑誘導SH-SY5Y細胞DNA損傷，提高細胞凋亡率[12]。已有研究報道單一農藥以及農藥和金屬物質混用對生物的毒性作用，鮮有報道研究多種農藥聯合暴露的生殖毒性作用。

精子的產生是一個復雜而連續的過程，包括精原細胞增殖、精母細胞減數分裂和精子細胞向精子的分化，其中，精原細胞在精子產生中起著至關重要的作用，在維持正常精子數量方面具有重要的生理意義[13-14]。目前的研究表明，毒死蜱和苯醚甲環唑在單獨暴露時具有明顯的生殖毒性，但關于毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露生殖毒性效應與機制的研究較少。因此，以小鼠精原細胞GC-1為模型，通過對不同濃度農藥進行細胞活力檢測，測定毒死蜱和苯醚甲環唑單獨和聯合暴露后其ROS、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)等氧化應激指標水平，并驗證凋亡相關蛋白的表達情況，從而研究毒死蜱和苯醚甲環唑單獨和聯合暴露對GC-1細胞的毒性作用，為評估這2種農藥對生殖系統的毒性作用提供依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

毒死蜱(chlorpyrifos, CPF)標準品(CAS: 2921-88-2，純度≥99.6%，Dr. Ehrenstorfer GmbH，德國)，苯醚甲環唑(difenoconazole, DFC)標準品(CAS: 119446-68-3，純度≥99.5%，Dr. Ehrenstorfer GmbH，德國)，小鼠精原細胞GC-1(實驗室原有)，DMEM高糖培養基(Hyclone，美國)，胎牛血清(GIBCO，美國)，0.25%胰蛋白酶(中科邁晨(北京)科技有限公司，中國)，青鏈霉素聯合液(Hyclone，美國)，二甲基亞砜(DMSO，AppliChem，德國)，Celltiter-Glo(Promega，美國)，ROS、MDA和GSH檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)，線粒體膜電位檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，中國)，PE偶聯Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒(BD Bioscience，美國)；PARP一抗(CST：9532)，Cleaved-PARP一抗(CST：94885)，Caspase3一抗(CST：9662)，Cleaved-Caspase3一抗(CST：9664)，Bax一抗(武漢塞維爾，GB11690)，β-Tublin一抗(CST：2128)。

1.2 細胞培養與染毒

GC-1細胞用含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素聯合液的DMEM完全培養基，于37 ℃、5% CO2細胞恒溫培養箱中培養。在細胞密度為90%時進行傳代培養，隔天換液，保證細胞處于對數生長期。根據Wang等[15]的研究，后續實驗的濃度基于毒死蜱和苯醚甲環唑2種藥物的半抑制濃度(IC50)設置。

1.3 細胞活力檢測

將毒死蜱、苯醚甲環唑2種標準品用DMSO溶解配制成濃度為500 mmol·L-1的儲備液，于-20 ℃保存。調整對數期細胞密度接種至96孔板，待細胞密度達到80%時，將農藥儲備液用DMEM完全培養基稀釋至0、0.195、0.039、0.078、0.156、0.313、0.625、1.25、2.50和5.00 mmol·L-1，并將不同濃度毒死蜱、苯醚甲環唑按每孔100 μL加入至96孔板中繼續培養。暴露24 h后，每孔加入50 μL Celltiter-Glo試劑，在15 min內通過酶標儀檢測其發光度，確定IC50，并檢測0、12、24、36和48 h的細胞生存率，得到相應的劑量-時間效應結果。

1.4 ROS含量檢測

采用DCFH-DA熒光探針法檢測細胞內ROS含量。取對數生長期細胞，加入2種藥物的單獨和聯合組合于T25細胞培養瓶中，DMSO溶劑作為對照。刺激細胞24 h后，按照ROS測試盒說明書加入DCFH-DA，37 ℃孵育30 min，然后加入胰酶細胞消化，加入培養基終止消化后離心，PBS清洗，收集細胞沉淀用PBS重懸，用酶標儀檢測細胞內ROS。

1.5 氧化應激指標檢測

取對數生長期的細胞，加入2種藥物的單獨和聯合組合，對照組為DMSO溶劑。刺激細胞24 h。除去多余培養基，洗滌1次，充分裂解細胞。12 000 r·min-1、4 ℃離心5 min，取上清液待測。按照MDA檢測試劑盒說明書配制MDA檢測工作液，向每組樣品中加入適量MDA檢測工作液，沸水浴加熱15 min。冷卻至室溫后，1 000 r·min-1離心10 min，取上清液測定532 nm處的吸光度值，通過計算得出樣品中MDA的含量。按照SOD檢測試劑盒說明書配制酶工作液以及反應啟動工作液，向每組樣品中加入適量工作液和緩沖液，充分震蕩混勻，37 ℃孵育30 min，立即測定450 nm處吸光度值，計算得到樣品中SOD的活性。按照GSH檢測試劑盒說明書配制總谷胱甘肽檢測工作液以及GSH清除試劑工作液，向每組樣品中加入適量工作液，充分混勻，25 ℃孵育5 min。然后向混合反應體系加入50 μL 0.5 mg·mL-1NADPH溶液終止反應，充分混勻后立即測定412 nm處的吸光度值，每5 min測定一次，共測定5次，歷時25 min，分別計算總谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量，然后計算GSH的含量。

1.6 細胞線粒體膜電位檢測

取對數生長期細胞，加入2種藥物的單獨和聯合組合，對照組為DMSO溶劑。刺激細胞24 h后，除去多余培養基并用PBS清洗，加入胰酶消化細胞，收集細胞并重懸。然后按照試劑盒說明書配制JC-1染色工作液和染色緩沖液，每組加入0.5 mL染色工作液后混勻放入細胞培養箱中37 ℃孵育20 min；取出后600g離心5 min，棄上清液并用染色緩沖液洗滌2次；0.5 mL染色緩沖液重懸細胞后用流式細胞儀進行檢測。

1.7 細胞凋亡檢測

取對數生長期細胞，加入2種藥物的單獨和聯合組合，對照組為DMSO溶劑。刺激細胞24 h后，消化離心收集細胞，加入1 mL PBS緩沖溶液重懸細胞，再次離心完成后加入1 mL試劑盒緩沖液重懸細胞。所有樣品管取300 μL至流式管中，每支流式管中加入2 μL 7-AAD和PE試劑，100 μL稀釋后的緩沖液，室溫下避光染色5～15 min，在1 h內用流式細胞儀進行檢測。

1.8 Western blot分析

常規收集各處理組的細胞提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。定量后將蛋白樣品置于金屬浴中100 ℃煮沸10 min，蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳至溴酚藍接近分離膠底部時停止；轉膜前，用甲醇激活PVDF膜，將蛋白質由聚丙烯酰胺凝膠轉移至0.20 μm PVDF膜；結束后采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，室溫孵育2 h；封閉結束后，用TBST快速洗膜3次，每次5～10 min；按照抗體說明書，配制適當濃度的一抗孵育液，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次5～10 min，然后放于合適濃度的二抗孵育液中室溫孵育1 h，TBST再次洗膜3次，每次5～10 min；清洗好的PVDF膜上滴加適量發光顯跡液，暴露于化學發光成像分析系統中檢測蛋白的表達。利用Image J軟件分析灰度值，確定蛋白的相對表達量。

1.9 統計學分析

使用SPSS 23.0進行統計學分析，實驗數據以Mean±SD表示，多組間均數的比較采用單因素方差分析，多個實驗組與一個對照組均數的比較用Dunnett法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果(Results)

2.1 細胞活力檢測

為評估毒死蜱、苯醚甲環唑單獨暴露以及2種藥物聯合暴露對GC-1細胞的影響，通過Cell titer檢測細胞暴露于農藥后的細胞活力。結果顯示，隨著藥物濃度的增加，細胞活力隨之下降(圖1(a)～(b))。計算得到毒死蜱、苯醚甲環唑對GC-1細胞的IC50分別為158.5 μmol·L-1和89.57 μmol·L-1。后續實驗使用濃度為毒死蜱200 μmol·L-1，苯醚甲環唑120 μmol·L-1；聯合組為毒死蜱200 μmol·L-1+苯醚甲環唑120 μmol·L-1。正常的GC-1細胞呈上皮樣細胞狀，暴露于不同濃度的毒死蜱和苯醚甲環唑24 h后，隨著染毒濃度的增加細胞形態逐漸呈不規則狀，出現圓形、回縮和細胞體積變小等變化。且在毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露組中，細胞形態改變情況更為顯著(圖1(c))。此外，研究毒死蜱、苯醚甲環唑2種藥物單獨和聯合暴露對細胞活力影響與時間的效應關系可知，隨著時間的增加，每組細胞活力都有增長，但與對照組細胞相比其生長明顯受到抑制(圖1(d)～(f))。

圖1 不同濃度毒死蜱(CPF)和苯醚甲環唑(DFC)對細胞活力的影響注：(a) 不同濃度毒死蜱對GC-1細胞活力的影響；(b) 不同濃度苯醚甲環唑對GC-1細胞活力的影響；(c) 毒死蜱、苯醚甲環唑單獨和聯合暴露下的細胞形態(50 μm)；(d) 不同濃度毒死蜱(0、75、150和300 μmol·L-1)暴露與GC-1細胞活力的時間效應曲線；(e) 不同濃度苯醚甲環唑(0、40、80和120 μmol·L-1)暴露與GC-1細胞活力的時間效應曲線；(f) 毒死蜱、苯醚甲環唑聯合暴露與GC-1細胞活力的時間效應曲線。Fig. 1 Effects of chlorpyrifos (CPF) and difenoconazole (DFC) at different concentrations on cell viability Note: (a) Effects of chlorpyrifos at different concentrations on cell viability of GC-1 cells; (b) Effects of difenoconazole at different concentrations on cell viability of GC-1 cells; (c) Cell morphology in groups exposed to different concentrations of chlorpyrifos and difenoconazole (50 μm); (d) Effects of chlorpyrifos at different concentrations (0, 75, 150 and 300 μmol·L-1) on cell viability of GC-1 cells after 0, 12, 24, 36 and 48 h exposure; (e) Effects of difenoconazole at different concentrations (0, 40, 80 and 120 μmol·L-1) on cell viability of GC-1 cells after 0, 12, 24, 36 and 48 h exposure; (f) Effects of chlorpyrifos and difenoconazole on cell viability of GC-1 cells after 0, 12, 24, 36 and 48 h exposure.

2.2 毒死蜱、苯醚甲環唑單獨和聯合暴露對GC-1細胞氧化應激水平的影響

研究表明，細胞中ROS的積累是由于ROS產生能力增加或其清除能力下降所致。在本研究中，GC-1細胞經毒死蜱、苯醚甲環唑單獨和聯合暴露24 h后，通過檢測MDA含量、ROS生成、GSH和SOD活性來分析氧化應激水平。結果表明，與對照組相比，毒死蜱、苯醚甲環唑單獨和聯合暴露后細胞ROS水平升高，并且與單獨暴露組相比，聯合暴露組細胞內ROS水平顯著升高(圖2(a))，表明毒死蜱、苯醚甲環唑單獨和聯合暴露后可以引起GC-1細胞產生ROS。與對照組相比，單獨暴露組細胞SOD和GSH活性低于對照組，MDA含量升高。與單獨暴露組相比，聯合暴露組細胞SOD和GSH活性顯著降低，細胞內MDA含量顯著升高(圖2(b)～(d))。

圖2 毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露對GC-1細胞氧化應激水平的影響注：(a) 活性氧(ROS)水平，(b) 丙二醛(MDA)含量，(c) 超氧化物歧化酶(SOD)活性，(d) 還原型谷胱甘肽(GSH)活性；數據表示為平均值±標準誤差，n=3；**P<0.01、***P<0.001，與對照組相比；## P<0.01、### P<0.001，與聯合暴露組相比。Fig. 2 Effect of combined chlorpyrifos and difenoconazole exposure on oxidative stress levels in GC-1 cellsNote: (a) Reactive oxygen species (ROS) level, (b) Malondialdehyde (MDA) content, (c) Superoxide dismutase (SOD) activity, (d) Glutathione (GSH) activity; all data were expressed as mean±S.E.M, n=3; **P<0.01, ***P<0.001, compared with DMSO control; ## P<0.01、### P<0.001, compared with the combined exposure group.

2.3 毒死蜱、苯醚甲環唑單獨和聯合暴露對GC-1細胞線粒體膜電位的影響

通過JC-1探針與流式細胞儀檢測毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露對GC-1細胞線粒體膜電位的影響，對照組中高電位/低電位的比率為61.5，毒死蜱組為11.05，苯醚甲環唑組為5.21，聯合暴露組為2.95，與對照組相比，毒死蜱、苯醚甲環唑單獨和聯合暴露誘導GC-1細胞線粒體膜電位下降，而且與單獨暴露組相比，聯合暴露組細胞線粒體膜電位顯著下降(圖3)。

圖3 毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露對GC-1細胞線粒體膜電位的影響注：***P<0.001，與對照組相比；### P<0.001，與聯合暴露組相比。Fig. 3 Effect of combined chlorpyrifos and difenoconazole exposure on the mitochondrial membrane potential of GC-1 cellsNote: ***P<0.001, compared with DMSO control; ### P<0.001, compared with the combined exposure group.

2.4 毒死蜱、苯醚甲環唑單獨和聯合暴露誘導GC-1細胞凋亡

毒死蜱、苯醚甲環唑單獨和聯合暴露GC-1細胞24 h，經Annexin V-PE雙染色、流式細胞儀檢測可知，與對照組相比，毒死蜱和苯醚甲環唑單獨暴露均能誘導GC-1細胞凋亡，毒死蜱暴露后細胞凋亡率為23.0%，苯醚甲環唑暴露后細胞凋亡率為25.0%，而聯合組的凋亡率顯著升高，為37.7%(圖4)。與單獨暴露組相比，聯合暴露組細胞凋亡率顯著提高，可見毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露明顯誘導GC-1細胞發生凋亡。

圖4 毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露對GC-1細胞凋亡率的影響注：(a) 與對照組相比，毒死蜱、苯醚甲環唑單獨和聯合暴露對GC-1細胞凋亡的影響，(b) 各處理組凋亡率；數據表示為平均值±標準誤差，n=3；***P<0.001，與對照組相比；### P<0.001，與聯合暴露組相比。Fig. 4 Effect of combined chlorpyrifos and difenoconazole exposure on the apoptosis rate of GC-1 cells Note: (a) Compared with DMSO control, the effects of chlorpyrifos and difenoconazole on apoptosis of GC-1 cells; (b) The apoptosis rate of each treatment group; all data were expressed as mean±S.E.M, n=3; ***P<0.001, compared with DMSO control; ### P<0.001, compared with the combined exposure group.

2.5 凋亡相關蛋白檢測

為進一步驗證毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露對GC-1細胞凋亡通路的影響，通過Western blot驗證單獨及聯合處理后相關蛋白Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3和Bax的表達情況。結果表明，與對照組相比，單獨和聯合暴露組Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3蛋白的表達上升，同時促凋亡蛋白Bax的表達明顯增加。與單獨暴露組相比，聯合暴露組Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3和Bax蛋白的表達明顯上升(圖5)，以上結果表明毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露誘導GC-1細胞凋亡蛋白表達提高。

圖5 毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露對GC-1細胞凋亡相關蛋白表達水平的影響注：(a) PARP、Cleaved-PARP、Caspase3、Cleaved-Caspase3和Bax蛋白條帶圖，(b) PARP定量分析圖，(c) Cleaved-PARP定量分析圖，(d) Caspase3定量分析圖，(e) Cleaved-Caspase3定量分析圖，(f) Bax蛋白定量分析圖；*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，與對照組相比；# P<0.05、## P<0.01、### P<0.001，與聯合暴露組相比。Fig. 5 Effect of combined chlorpyrifos and difenoconazole exposure on the expression levels of apoptosis-related proteins in GC-1 cellsNote: The expressions of apoptosis-related proteins of PARP, Cleaved-PARP, Caspase3, Cleaved-Caspase3 and Bax, (b)～(f) Relative protein expression levels of (b) PARP, (c) Cleaved-PARP, (d) Caspase3, (e) Cleaved-Caspase3 and (f) Bax normalized to β-Tublin; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, compared with DMSO control; # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001, compared with the combined exposure group.

3 討論(Discussion)

毒死蜱效力持久，是目前世界上農業生產中使用最為廣泛的有機磷農藥[3,16]。苯醚甲環唑作為一種典型的三唑類殺菌劑在農業生產中廣泛使用，已有報道其會對人類健康尤其是男性生殖系統產生不良影響。作為雄性生殖系統中最重要的器官，睪丸的主要作用是分泌和合成雄激素，生成精子[17]。精子發生是一個從精原細胞到精母細胞再到精子細胞的有序發展過程，包括細胞增殖、分化和凋亡等協調有序的過程。精原細胞在維持正常的精子發生和精子數量方面起著重要的作用。細胞凋亡是一種進化保守的細胞程序性死亡機制，在精子發生中起重要作用。在男性生殖細胞的發育過程中，約有75%的生殖細胞通過凋亡調節生殖細胞與支持細胞的數量和比例[18-19]。有研究表明，細胞凋亡主要影響精原細胞而不是精母細胞，生殖細胞的凋亡可能是自發發生的，也可能由某些物理刺激、化學試劑等引發的[20]。例如，乙草胺作為一種除草劑，可以造成大鼠DNA損傷以及誘導小鼠精原細胞GC-1凋亡[17]。本研究以小鼠精原細胞GC-1為暴露模型，研究毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露對GC-1細胞的毒性效應與機制，以期為農藥暴露對人類生殖系統的毒性作用研究提供一定的理論依據。

本研究通過Cell titer法檢測GC-1細胞暴露于0～500 mmol·L-1毒死蜱和苯醚甲環唑24 h后所受的毒性影響，結果表明隨著暴露濃度的增加，細胞活力呈劑量依賴性降低。2種藥物對GC-1細胞的IC50分別為毒死蜱158.5 μmol·L-1，苯醚甲環唑89.57 μmol·L-1。調整濃度為毒死蜱200 μmol·L-1，苯醚甲環唑120 μmol·L-1，聯合組為毒死蜱200 μmol·L-1+苯醚甲環唑120 μmol·L-1進行后續實驗。研究毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露0、12、24、36和48 h后對GC-1細胞活力的影響，結果表明，與對照組相比，隨著藥物濃度的增加，細胞活力受到抑制，而且細胞活力有良好的時間-劑量對應關系。

在正常生理條件下，生物體內ROS的產生和清除始終處于相對平衡的狀態，但當農藥等外源物質在體內積累到一定程度時，會產生大量ROS。這些有害物質的產生會導致抗氧化防御的改變，從而導致氧化應激[21]?？寡趸烙鶛C制能夠清除多余ROS并且預防組織因氧化應激產生的損傷，產生抗氧化酶(SOD、CAT等)和非酶類抗氧化物質(GSH等)。其中，抗氧化酶通過清除過量ROS來保證自由基的正常代謝，使其恢復動態平衡[22]。在生物體內，ROS處于一種動態平衡狀態，在細胞增殖和存活的信號轉導中起著關鍵作用，其也被認為是一種重要的凋亡信號，對農藥的毒性研究具有重要意義[23]。大量研究數據表明，氧化應激可以由化學物質誘導，并在生殖毒性中發揮重要作用。例如，鄰苯二甲酸二乙己酯(DEHP)可顯著增加小鼠GC-1細胞中MDA含量，抑制GSH和SOD活性[24]。已有研究發現毒死蜱暴露會增加小鼠大腦中的氧化應激，苯醚甲環唑誘導人肝癌細胞HepG2中ROS產生，并誘導其凋亡[25-26]。為了進一步探討氧化應激在毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露誘導的GC-1細胞損傷中的作用機制，我們研究了不同劑量毒死蜱、苯醚甲環唑單獨以及聯合暴露對GC-1細胞ROS生成和MDA水平的影響。結果表明，與對照組相比，所有處理組細胞中ROS和MDA含量都顯著增加，且毒死蜱和苯醚甲環唑的聯合暴露組中的ROS和MDA含量明顯高于單獨暴露組，表明ROS濃度增加，毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露對GC-1細胞生存產生了不良影響。而通過對GC-1細胞的抗氧化能力檢測發現，與對照組相比，所有處理組細胞中SOD和GSH活性都降低，且聯合暴露組中的SOD和GSH活性明顯低于單獨暴露組，進一步表明聯合暴露組的抗氧化應激水平低于對照組和單獨暴露組。當細胞內ROS升高和SOD、GSH活性下降時，會進一步加重細胞內的氧化應激損傷，本研究結果表明，毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露可明顯增加GC-1細胞ROS和MDA的生成，降低細胞內SOD和GSH活性，降低抗氧化能力，導致GC-1細胞氧化損傷，充分說明毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露后顯著誘導GC-1細胞發生氧化應激效應，也從細胞水平說明了氧化應激效應可能是毒死蜱和苯醚甲環唑對GC-1細胞產生毒性的誘因。

線粒體作為精子細胞主要的供能細胞器，在維持細胞正常的生理活動中起重要作用，而線粒體膜電位下降會導致線粒體功能異常進而影響精子細胞的活力，是精子細胞發生凋亡的早期信號。Jiang等[27]的研究表明，毒死蜱暴露誘導豬卵母細胞氧化應激和線粒體功能損傷，進而導致細胞凋亡。Wang等[28]研究報道苯醚甲環唑通過ROS相關的Caspase途徑誘導HepG2細胞毒性和凋亡。本研究結果表明，與單獨暴露組相比，毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露導致GC-1細胞線粒體膜電位顯著降低。同時檢測細胞凋亡率發現，與單獨暴露組相比，聯合暴露組細胞凋亡率明顯上升。細胞凋亡是一種主動的死亡過程，受外源性途徑和內源性途徑控制，其中涉及線粒體的內源性途徑是凋亡的重要途徑之一[29]。通過激活半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)導致線粒體膜通透性增加、染色質凝聚和DNA斷裂，從而使細胞核固縮、碎裂并促進凋亡小體的形成[30]。Bcl-2蛋白家族與線粒體凋亡途徑密切相關，根據Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡過程中的作用不同，其可以分為2種類型，一種是促凋亡蛋白，如Bax，另一種是抗凋亡蛋白，如Bcl-2[31]。有研究表明通過增加Bax/Bcl-2的比值來提高Caspase3的活性從而誘導細胞凋亡[32]。GC-1細胞暴露于濃度為200 mg·mL-1的鎳納米粒子后Bax和Caspase3表達增強[33]。在本研究中，與對照組相比，毒死蜱和苯醚甲環唑聯合暴露后，GC-1細胞內促凋亡蛋白Bax以及相應的效應蛋白如Cleaved PARP、Cleaved Caspase3的表達升高。

綜上所述，毒死蜱、苯醚甲環唑單獨和聯合暴露均能降低GC-1細胞活力，并誘導細胞氧化應激，降低細胞的抗氧化能力，降低線粒體膜電位，提高GC-1細胞凋亡率，且升高細胞內Cleaved PARP、Cleaved Caspase3和Bax等蛋白的表達水平從而誘導細胞凋亡，并且相比于單獨暴露，2種農藥聯合暴露對GC-1細胞的毒性效應更強。但是農藥聯合暴露誘導細胞凋亡的作用機制復雜，需要進一步通過基因測序和動物實驗探究其農藥效應靶點、凋亡調控通路，為評估農藥聯合毒性機制提供科學依據。