Siglec-15對胃癌細胞系MKN-45增殖和凋亡作用的影響

丁祥林，張光波，謝金晶

（1.蘇州永鼎醫院，江蘇 蘇州 215200；2.蘇州大學附屬第一醫院臨床免疫所，江蘇 蘇州 215006）

在全球胃癌確診患者中，東亞國家人數約占一半，且胃癌一經發現常診斷為晚期[1-2]，胃癌的發生和發展給社會造成了沉重的負擔，這一癌癥的診斷和治療技術亟待提高[3]，更好地了解胃癌發生發展的分子機制，探索新的標志性分子，并將其運用到免疫治療和靶向治療中，對胃癌的診斷和治療具有重要意義。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素（Siglec）-15是免疫調節家族成員之一[4]，在哺乳動物中具有高度保守性，其受體主要為抑制性受體，存在于造血系統的細胞上，包含受體酪氨酸抑制基序（ITIM），抑制免疫應答[5]。Siglec-15不僅能夠維持破骨細胞的細胞形態和活性[6]，也在抗腫瘤免疫中發揮著重要作用[7-8]。本文主要探究Siglec-15在胃癌進展中的分子機制，希望為治療胃癌提供新的潛在治療靶點。本研究經免疫組織化學和Western blotting實驗發現Siglec-15在人腎癌組織標本及細胞系MKN-45中高表達，為進一步研究Siglec-15對胃癌細胞生物功能的影響以及存在的可能分子機制，通過慢病毒轉染MKN-45建立Siglec-15低表達穩轉細胞系進行體外實驗，研究MKN-45細胞生物學功能變化，探究Siglec-15對胃癌細胞的作用機制，本次研究發現，Siglec-15能夠促進腫瘤細胞增殖和抑制凋亡進程，促進腫瘤進展。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 胎牛血清（Gibico，美國）；RPMI 1640培養基、DMEM培養基、磷酸鹽緩沖液（Hclycon，美國）；青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶消化液、細胞周期試劑盒（碧云天公司，中國）；10% ExpressCast PAGE彩色凝膠快速試劑盒（新賽美公司，中國）；RT-qPCR試劑盒（諾唯贊，中國）；Annexin Ⅴ-PE細胞凋亡檢測試劑盒（Becton，Dickinson and Company，美國）；化學發光顯影液（翊圣公司，中國）；Siglec-15抗體（上海生工，中國）；Apaf-1抗體、β-actin抗體（碧云天公司，美國）；Caspase-3、Caspase-9抗體（Proteintech，美國）。CO2培養箱、酶標儀（Thermo，美國）、凝膠成像系統（BIO-RAD，美國）、實時定量PCR儀（Beckman，美國）。

1.2 細胞株 胃癌細胞株786-O購自中國科學院細胞庫。

1.3 細胞培養 MKN-45細胞培養于10%胎牛血清+45% RPMI 1640+45% DMEM+1%青霉素-鏈霉素培養基中，37 ℃，5% CO2濃度培養箱中靜置培養。

1.4 s h R N A 慢病毒表達載體 S i g l e c-1 5 及陰性對照組慢病毒由上海吉瑪公司設計并合成，滴度：1×1 08T U/m L，慢病毒干擾載體為p G LV 2-U 6-P u r o-G F P Ve c t o r，序列：5'-GGGTTCTCCCGACAGGCTCAT-3'。

1.5 免疫組織化學實驗 將石蠟切片機切好的組織進行融蠟、脫水以及洗滌處理，于檸檬酸鹽緩沖液中水浴加熱至100 ℃，時間3 min，使用PBST洗滌切片，免疫組化筆在組織周圍圈出阻水范圍，加入免疫抗原修復緩沖液，常溫避光反應5 min，PBST洗滌，加入免疫封閉液，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌，一抗4 ℃孵育18 h，PBST洗滌，二抗37 ℃孵育30min，PBST洗滌后滴加DAB染色液，使用蘇木素復染，中性樹脂封片，晾干后于正置顯微鏡下選取合適的視角拍照。免疫組織化學的評分標準根據四級評分進行。實驗重復3 次以上。

1.6 Western blotting實驗 使用含有10%磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的細胞裂解液裂解對數生長期的細胞，收集細胞總蛋白，離心12 000 g，20 min后取上清，按照等比例與1×SDS上樣緩沖液混合，95.5℃金屬浴5 min使蛋白樣品變性，根據每孔25 μg的上樣量進行150 V恒壓凝膠電泳，按照三層濾紙、電泳后的凝膠、PVDF膜以及三層濾紙的順序放入轉膜裝置中，恒流轉膜，5%脫脂牛奶水平搖床室溫封閉2 h，一抗（Siglec-15、Apaf-1、caspase-3、p-PI3K等）水平搖床低速搖晃孵育3 h，TBST溶液洗滌，二抗水平搖床低速搖晃孵育1 h，膜上滴加化學發光試劑，凝膠成像系統記錄結果。實驗重復3次以上。

1.7 RT-qPCR實驗 使用總RNA快速提取試劑盒提取細胞總RNA，檢測細胞總RNA的純度（OD＝A260/A280），若RNA純度值在1.9～2.0范圍內，則可以用于后續cDNA的合成，使用諾唯贊RT-qPCR試劑盒，以GAPDH為內參，根據試劑盒說明書進行RT-qPCR，根據基因循環數分析目的基因的相對表達。實驗重復3 次以上。

1.8 構建siglec-15低表達穩轉MKN-45細胞株 將生長至85%左右的MKN-45細胞消化離心，調整細胞密度為1.0×104個/mL，加入2 mL細胞懸液至六孔板中，37 ℃培養箱中培養12 h，根據病毒滴度公式計算所需病毒體積（MOI＝20）加入慢病毒，24 h后更換新鮮培養基，使用4 μg/mL嘌呤霉素進行陽性篩選，RT-qPCR和Western blotting實驗驗證病毒轉染效率，獲得Siglec-15低表達穩轉細胞株（MKN-45-LV-sh-S15）和陰性對照組（MKN-45-LV-NC）。實驗重復3 次以上。

1.9 CCK-8法檢測細胞增殖能力 將MKN-45-LVsh-S15和MKN-45-LV-NC根據相同細胞數量接種于96孔板中，37 ℃培養箱中培養12 h后，分別于0、24、48、72 h四個時間點加入CCK-8試劑，培養條件下反應2 h后，使用450 nm波長酶標儀檢測細胞吸光度值，細胞增殖率（%）＝(處理組OD450-空白組OD450)/(對照組OD450-空白組OD450)×100%。實驗重復3 次以上。

1.10 細胞克隆形成實驗 將對數生長期的MKN-45-LV-sh-S15和MKN-45-LV-NC細胞消化離心，將細胞懸液進行梯度倍數稀釋，以每孔600 個細胞的細胞密度接種于六孔板中。37 ℃培養箱中培養2～3周，期間觀察細胞是否形成克隆，當培養板中出現肉眼可見的克隆時，對細胞克隆進行清洗、固定以及染色處理，拍照記錄兩組的細胞克隆數。實驗重復3 次以上。

1.11 流式細胞術檢測細胞凋亡和周期的變化 使用細胞凋亡試劑盒和細胞周期試劑盒檢測MKN-45的Siglec-15穩定低表達組與對照組細胞的細胞周期和細胞凋亡效率，實驗操作按照試劑盒說明書進行，流式細胞術檢測細胞周期和凋亡情況并記錄結果。實驗重復3 次以上。

1.12 統計學方法 使用SPSS 26.0統計學軟件、ImageJ以及GraphPad Prism 7.0進行數據分析處理，兩組間比較采用非配對t檢驗，P＜0.05表明差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Siglec-15在胃癌標本及胃癌細胞系中的表達 免疫組織化學檢測胃癌標本以及胃息肉中Siglec-15的表達發現（圖1A，見封二），Siglec-15在胃癌中期組織中的表達高于胃息肉以及胃癌早期組織，差異具有統計學意義（P＜0.05）。RT-qPCR和Western blotting檢測正常胃細胞GSE-1和胃癌細胞系MKN-45、AGS以及MGC-803細胞中Siglec-15的表達發現（圖1B，1C，見封二），相比正常胃細胞，Siglec-15在胃癌細胞中的mRNA以及蛋白水平表達升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。其中，MKN-45細胞中Siglec-15的表達處于中等水平，因此使用該細胞系進行后續研究。

2.2 慢病毒載體構建Siglec-15低表達細胞株 使用慢病毒載體敲低MKN-45上Siglec-15的表達，空載體慢病毒作為對照組（陰性對照，LV-NC）。RT-qPCR檢測Siglec-15 mRNA表達水平發現（圖2A），MKN-45-LV-sh-S15組細胞中Siglec-15mRNA表達水平低于MKN-45-LV-NC組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。Western blotting實驗檢測Siglec-15蛋白表達水平發現（圖2B），MKN-45-LV-sh-S15組中Siglec-15蛋白表達水平低于MKN-45-LV-NC組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 Siglec-15對胃癌細胞系MKN-45增殖和細胞克隆形成的影響 使用CCK-8實驗檢測MKN-45細胞增殖能力的變化發現（圖3A，見封二），MKN-45-LVsh-S15組細胞在24、48、72 h三個時間點的OD450明顯低于MKN-45-LV-NC組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。細胞克隆形成實驗檢測細胞克隆率發現（圖3B，見封二），MKN-45-LV-sh-S15組細胞的克隆數目低于MKN-45-LV-NC組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結果表明敲減Siglec-15的表達，對MKN-45細胞的增殖和克隆形成能力具有抑制作用。

圖2 構建Siglec-15分子低表達穩轉細胞系

2.4 Siglec-15對胃癌細胞系MKN-45凋亡和細胞周期的影響 使用流式細胞術檢測MKN-45細胞凋亡的變化發現（圖4A），MKN-45-LV-sh-S15組細胞早期凋亡細胞百分率明顯高于MKN-45-LV-NC組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；MKN-45-LV-sh-S15組細胞晚期凋亡百分率與MKN-45-LV-NC組細胞相比差異無統計學意義（P＞0.05）。PI染色法測定細胞周期發現（圖4B），MKN-45-LV-sh-S15組細胞在G0/G1期所占百分比低于MKN-45-LV-NC組細胞，差異具有統計學意義（P＜0.05）；S+G2/M期MKN-45-LV-sh-S15組所占的百分率高于MKN-45-LV-NC組，細胞在S+G2/M期受到阻滯，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結果表明敲減MKN-45細胞上Siglec-15的表達，細胞凋亡水平升高。

圖4 敲低Siglec-15分子表達對MKN-45細胞凋亡和周期的影響

2.5 Siglec-15對MKN-45凋亡相關蛋白和信號通路相關蛋白表達的影響 Western blotting實驗檢測敲減MKN-45細胞上Siglec-15表達凋亡相關蛋白的表達發現（圖5A），相比MKN-45-LV-NC組細胞，MKN-45-LV-sh-S15組中Apaf-1、Cleaved-caspase-3以及Cleaved-caspase-9的表達明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。隨后檢測PI3K/AKT通路蛋白發現（圖5B），MKN-45-LV-sh-S15組中PI3K和AKT的磷酸化水平明顯低于MKN-45-LV-NC組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。實驗結果進一步表明敲減MKN-45細胞上Siglec-15的表達能夠誘導細胞凋亡，并且其調控可能有PI3K/AKT信號通路的參與。

圖5 敲低Siglec-15分子表達對MKN-45細胞凋亡相關蛋白和信號通路相關蛋白表達的影響

3 討論

Siglec-15在2007年被Takashi等[9]發現和研究，又稱為CD33L3和HsT1361。Siglec-15與其他Siglecs家族成員相比具有一定的差異性，最初發現其可以促進破骨細胞分化，維持細胞活性，是骨質疏松的治療靶點之一[10-12]。但隨后研究[7]發現，其胞外結構域與B7家族成員間存在20%左右的相似性，表明Siglec-15也可能具有免疫調節功能。進一步研究[13]發現，Siglec-15是免疫細胞上的膜表面受體，可以識別腫瘤細胞上的唾液酸聚糖，從而在腫瘤微環境中發揮抗腫瘤作用。Chen等[8]于2018年揭示了Siglec-15在腫瘤調控中的具體功能機制，Siglec-15可能是一種有效的免疫抑制分子，為未來腫瘤治療提供了新的治療靶點。另外，Siglec-15在多種惡性腫瘤細胞中過度表達，包括肝癌、腎癌以及肺癌等[9,14]，但其具體作用模式并沒有詳細闡述，因此本文主要探究Siglec-15在胃癌細胞中的表達模式及作用機制，為胃癌的靶向治療和免疫治療提供新的切入點。

胃癌是世界上最致命的癌癥類型之一，目前幽門螺桿菌感染是已知的誘發胃癌的主要原因之一[15-16]，隨著食品保鮮技術和幽門螺桿菌治療技術的進步，胃癌的發生率逐年減少，但胃癌患者的康復率極低[17-18]，且一經發現經常為晚期，患者的存活時間較短，目前的治療方法有限，亟需具有針對性的精準有效的治療靶標。通過免疫組織化學我們發現，相對于胃息肉以及胃癌早期組織標本，Siglec-15在胃癌中期組織標本中表達較高，認為Siglec-15在胃癌的進展過程中可以作為一種潛在的標志性分子參與腫瘤進展。隨后我們通過構建慢病毒Siglec-15低表達穩轉細胞株，探究Siglec-15對胃癌細胞生物學功能的影響，了解其在腫瘤進展中具體作用機制。胃癌目前仍是世界上的主要致死性癌癥之一，晚期治療主要依靠化療方式以及放化療結合的方式進行。隨著科學技術的進步，靶向治療以及免疫治療逐漸成為人們的研究熱點[19-21]，如何減緩腫瘤進展是胃癌治療過程中我們始終關心的問題，針對這一問題我們探究Siglec-15對胃癌細胞存活的作用機制，通過CCK-8實驗、細胞克隆形成以及周期凋亡實驗我們發現，Siglec-15對胃癌細胞的凋亡具有抑制作用，MKN-45細胞上敲減Siglec-15的表達后，凋亡相關蛋白Apaf-1以及Caspase-3、Caspase-9剪接體的表達降低，并且能夠通過提高胃癌細胞增殖能力，促進胃癌進展。相關研究[22-23]發現，Siglec-15作為免疫調節分子，主要通過NF-κB信號通路，抑制免疫細胞活性，發揮抗腫瘤免疫作用。但我們進一步的信號通路探究發現，Siglec-15可能通過PI3K/AKT通路抑制腫瘤細胞的凋亡和促進細胞增殖能力，然而具體作用機制仍需要進一步的實驗驗證。

綜上所述，敲減胃癌細胞系M K N-4 5 上Siglec-15的表達能夠抑制腫瘤細胞的增殖和克隆形成能力，誘導細胞凋亡，并且這一過程可能存在PI3K/AKT信號通路的調控，但仍需進一步的實驗進行驗證其具體調控機制。