黃瓜皺葉突變體的表型鑒定及遺傳分析

朱高翔 張美迪 宋曉飛 崔浩楠 李曉麗 朱雪云 閆立英

摘要：以黃瓜皺葉突變體 lc 及其野生型自交系樂亭白黃瓜為試材，研究其主要農藝性狀、葉綠素含量、光合特性、表皮細胞形狀、葉肉細胞排列和遺傳規律。與野生型相比，突變體 lc 表現為葉片皺縮、葉形改變、葉基部沿凹陷處緊靠攏、株型緊湊、植株長勢正常。突變體葉綠素 a 含量顯著高于野生型，達 15.2%，而二者之間葉綠素 b、類胡蘿卜素 c和葉綠素 a/b 的含量均無顯著差異;皺葉突變體的 Pn和 Tr顯著高于野生型，分別提高 28.4%和 30.4%，Gs極顯著高于野生型，提高 38.6%，二者間 Ci差異不顯著。遺傳規律分析表明，皺葉突變表型由單隱性核基因控制，命名為 Cslc。

關鍵詞：黃瓜;皺葉;葉綠素含量;光合特性;遺傳分析

中圖分類號：S642.2

文獻標志碼：A

文章編號：1673-2871（2022）03-009-07

Abstract： In this study， a crinkled leaf mutant lc and its wild-type inbred line Laoting White cucumber were used as testmaterials to evaluate main agronomic traits， chlorophyll content， photosynthetic characteristics， epidermal cell shape，mesophyll cell arrangement and inheritance of the mutant. Compared with wild type， the mutant showed crinkled leaf，changed leaf shape， closed leaf base along the depression， compact plant and normal plant growth. The content of chloro phyll a in mutant was 15.2% higher than that in wild-type， but the content of chlorophyll b， carotenoid c and chlorophyll a/bhad no significant difference between the mutant and wild type. The net photosynthetic rate（Pn）and transpiration rate（Tr）of the mutant were 28.4% and 30.4% higher than those of the wild type. The stomatal conductance（Gs）of themutant was 38.6% higher than that of the wild type. Intercellular CO2 concentration（Ci）had no significant differencebetween the mutant and wild type. Genetic analysis suggests that the mutant phenotype of crinkled leaf is controlled by asingle recessive nuclear gene named Cslc.

Key words： Cucumber; Crinkled leaf; Chlorophyll content; Photosynthetic characteristics; Genetic analysi

黃瓜（Cucumis sativus L.）屬于葫蘆科甜瓜屬植物，是高產高效的世界性蔬菜，具有食用、保健、美容等功效，種植地域范圍廣，是我國主要栽培的蔬菜作物之一。黃瓜在河北省產業頗具規模，播種面積大、產量高，據河北省農業農村廳資料顯示，2018年河北黃瓜播種面積及產量均位于全省蔬菜品類第二，僅次于大白菜[1-2]。株型是與黃瓜產量密切相關的重要性狀，是植物器官生長狀態的表型結構。葉形是構成理想株型的重要組成部分[3-6]，直接影響黃瓜植株的光合效率，進而影響果實品質和產量[7]。

葉片皺縮卷曲是“理想株型”的重要表現之一，影響植株的光合效率和蒸騰速率。迄今為止，在棉花、大麥、水稻和玉米等作物中均發現了葉片皺縮突變體，但是葉片皺縮的原因各不相同。1937 年Harland 在海島棉中發現一種“矮皺突變體”（crin kled dwarf），他認為該性狀是葉肉與葉脈延展不平衡所致[8]。高陽[9]使用高通量測序技術，以突變體及其近等基因系的棉花莖尖為材料，進行轉錄組測序獲得 Unigene 序列，以此為參照序列進行數字表達譜分析，篩選差異基因。通過數字表達譜分析、KEGG 分析等途徑從中挑選出 10 個相關基因，利 用 qRT-PCR 在葉皺小突變體根尖、莖尖中進行驗證，其表達量與數字表達譜結果一致。為了驗證這10 個基因與葉皺小突變體的產生是否相關，進一步利用 VIGS 技術抑制其在野生型中的表達，結果發現在野生型中沉默掉 ABCB19 基因出現與葉皺小突變體相似的表型。這一結果進一步證實葉皺小突變體的產生與生長素密切相關。

Jarvi 等[10]首次報道大麥籽粒皺縮自然突變體，并通過易位試驗將大麥皺縮突變體 seg4 定位到 1號染色體上，但迄今為止大麥皺縮突變體 seg4 的分子機制尚不清楚;孫敏[11]通過對籽粒飽滿的 BM42（Bowman）和籽粒皺縮突變體 BM3 進行轉錄組分析，結果發現含有 SNP 數量最多的染色體是 6H，并進一步對花后 3 個不同時期檢測到的 2087 個非重復的差異表達基因進行 KEGG 通路富集分析、主成分分析、表達模式聚類分析及蛋白質互作網絡預測，篩選出 12 個差異表達基因，推測這些基因可能與大麥皺縮突變有關。粘金沯[12]通過圖位克隆技術將水稻葉尖皺縮扭曲突變基因 LTR1 初步定位于第2 條染色體上，位于 RM6318 和 RM1920 標記之間;進一步擴大群體，最終將 LTR1 精細定位在兩個標記 STS-N12 與 CAPS-N20 之間、物理距離約 12.3kb 的候選區域內，LTR1 基因是一個控制葉片形態發育的新基因，該基因與葉片表型之間的關系及其調控分子機制還有待于進一步驗證。李峰利[13]在陸地棉中獲得一個自然突變的棉花皺葉突變體 wr3，通過 BSA 方法和圖位克隆將 wr3 定位在 21 號染色體的 NAU3740 和 cgr5428 兩個標記之間，遺傳距離分別為 4.8 cM 和 10.4 cM。周練等[14]用甲基磺酸乙酯（EMS）處理玉米自交系 Mo17 花粉得到一個葉片皺縮突變體 wl1;通過分析定位區間候選基因在玉米葉中的表達水平、全基因組測序以及與 7 個不同 玉 米 自 交 系 的 序 列 比 對 ，初 步 預 測Zm00001d027266 基因為玉米皺葉突變體 wl1 的候選基因，該基因 Zm00001d027266 CDS 序列第 797個堿基由 G 轉變為 A，導致該位點編碼的絲氨酸替換為天冬氨酸，這可能是 wl1 表型產生的原因。周世奇等[15]利用航天誘變方法獲得煙草品種 NC89 的突變體 NC89-M，與野生型相比，NC89-M 葉形呈寬橢圓，葉面褶皺，葉緣呈鋸齒狀。通過混合集團分離法，確定 SSR 標記 PT60795 與葉形性狀連鎖。利用已有的突變體基因組序列信息，開發 InDel 標記最終將突變基因 nc89m 定位于標記 PT60795 與 In Del5 之間，遺傳距離分別為 2.9 cM 和 4.4 cM。在該 區 間 內 發 現 在 葉 片 中 高 表 達 的 基 因 Nit ab4.50000008g0880.1 編碼區第 1294 個核苷酸發生突變，由腺嘌呤突變為胞嘧啶，其編碼氨基酸由酪氨酸突變為天冬氨酸，因此將其作為 nc89m 的候選基因。

發掘和鑒定新的皺葉材料，開展皺縮突變基因的定位、克隆等對“理想株型”研究具有重要的理論意義和應用價值。河北科技師范學院黃瓜遺傳育種課題組前期在黃瓜地方資源樂亭白黃瓜自交系中發現了一份自然突變的皺葉突變體。與野生型相比，突變體葉片皺縮、葉形改變、葉基部沿凹陷處緊靠攏、株型緊湊、植株長勢正常。目前黃瓜葉片皺縮的原因及其分子機制尚不清楚。筆者以 lc 突變體及其野生型樂亭白黃瓜自交系為材料，對其苗期和結果期的主要農藝性狀、葉綠素含量、光合特性、細胞形態及遺傳規律進行了研究，為定位、克隆皺葉突變基因奠定材料基礎。

1?材料與方法

1.1 材料

以黃瓜地方資源樂亭白黃瓜自交系及其皺葉突變體（lc）為試驗材料。樂亭白黃瓜是河北科技師范學院對唐山地區地方種質資源純化所得的優良自交系;皺葉突變體是在樂亭白黃瓜自交系中發現的自然突變體。

1.2 方法

1.2.1 形態特征和主要農藝性狀調查 試驗于2021 年春季在河北科技師范學院施各莊試驗基地進行。在日光溫室中育苗，于 1 月 20 日播種，2 月16 日定植。雙行定植，株距 25 cm，大行距 80 cm，小行距 50 cm。野生型親本（P1）定植 29 株，突變體lc 親本（P2）定植 10 株，F1 定植 13 株，F2 定植 180株，常規田間栽培管理。在結果盛期對突變體 lc 及其野生型親本樂亭白黃瓜各選擇長勢基本一致的 6株植株進行主要農藝性狀的調查。主要農藝性狀的調查參照李錫香等[16]編著的《黃瓜種質資源描述規范和數據標準》，并稍作改動。

葉片長：結果盛期，主蔓中部最大葉片基部到葉先端的長度，單位 cm。

葉片寬：結果盛期，主蔓中部最大葉片最寬處的寬度，單位 cm。

葉面積：透明方格板法，單位 cm2。

葉柄長：結果盛期，主蔓中部最大葉葉柄的長度，單位 cm。

葉柄著生角度：結果盛期，最大葉葉柄與主蔓自然夾角的角度，單位（°）。

株高：結果盛期，地面至植株最高點的高度，單 位 cm。

株幅：結果盛期，植株葉片伸展的最大距離，單 位 cm。

節間長：結果盛期，植株主蔓中部最大葉所在節的節間長度。單位 cm。

節數：可見葉片，節間長大于 1 cm 的節數。

雄花花冠直徑：盛開當天上午，雄花花冠的直徑，單位 cm。

雄花花瓣長：盛開當天上午，雄花花瓣的長度，單位 cm。

雄花花瓣寬：盛開當天上午，雄花花瓣的寬度，單位 cm。

瓜長：結果盛期，正常商品瓜瓜蒂至瓜頂的長度，單位 cm。

瓜橫徑：結果盛期，正常商品瓜距瓜頂 1/3 處的橫徑，單位 cm。

把瓜比：結果盛期，正常商品瓜瓜把長/瓜長。

腔徑比：結果盛期，正常商品瓜中心腔直徑/瓜橫徑。

可溶性固形物含量：100 g 新鮮商品瓜瓜肉所含可溶性固形物的克數，單位%。

1.2.2 遺傳分析 試驗于 2019 年春季在河北科技師范學院施各莊試驗基地進行。在日光溫室中育苗，于 3 月 22 日播種，4 月 9 日定植。雙行定植，株 距 25 cm，大行距 80 cm，小行距 50 cm。野生型親本（P1）、突變體 lc 親本（P2）、F1和 F1 反各定植 38 株， F2定植 226 株，常規管理。 苗期分別觀察統計野生型親本、突變體親本、F1、F1 反和 F2植株的葉片皺縮分離情況，并采用 SAS 統計分析軟件對調查結果進行卡平方測驗（χ2）檢測分離比適合度，分析黃瓜葉片皺縮性狀的遺傳規律。 1.2.3 葉綠素含量的測定 結果盛期，分別取皺葉突變體 lc 和野生型樂亭白黃瓜生長點以下第 4 片成熟新鮮葉，采用乙醇浸提法提取葉綠素[17]。雙親各選 3 株，每株設 3 次生物學重復，每次重復稱取0.1 g 葉片放入 10 mL 離心管中，加入 5 mL95%的乙醇溶液 5 mL，避光浸泡 96 h，浸泡過程中每天顛倒混勻 2 次，葉片完全脫色后使用上海儀電分析儀器有限公司生產的 INESA765 型分光光度計測定消光度值，計算葉綠素 a、葉綠素 b 和類胡蘿卜素 c 的含量;以 95%乙醇溶液作為空白對照，溶液分別于波長為 665 nm、649 nm 和 470 nm 下進行比色，所測的吸光度（OD）代入下列公式，得到葉綠素 a（Chla）、葉綠素 b（Chlb）、類胡蘿卜素 c（Caro）含量（mg·g-1）。

1.2.4 光合作用參數測定 在結果盛期利用德國Walz 公司生產的便攜式光合熒光測量系統——GFS-3000 于晴天 9：00—11：00，測定突變體 lc 及野生型樂亭白黃瓜的葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）與細胞間隙 CO2 濃度（Ci）等指標。測定時儀器使用開放式氣路，測定光源為 LED紅藍光源，光強設為 1000 μmol·m-2 ·s-1）。皺葉突變體和野生型各選 3 株，每株在生長點下第 5 片真葉測定光合作用參數。

1.2.5 表皮細胞掃描電鏡觀察 選取突變體 lc 和野生型樂亭白黃瓜植株生長點下第 5 片葉片觀察表皮細胞形態。切取雙親相同部位的葉片（面積為3 mm×3 mm），放入青霉素小瓶中加入戊二醛固定液固定，抽真空處理，4 ℃過夜，脫水，噴金處理，通過掃描電鏡觀察葉片表皮細胞形態[18]。

1.2.6 石蠟切片觀察葉肉細胞 參照高東菊[8]的方法并作修改。選取黃瓜皺葉突變體 lc 和野生型樂亭白黃瓜植株新鮮葉片觀察葉肉細胞形態。切取相同部位的葉片，FAA 固定液固定，抽真空處理， 4 ℃過夜，用不同濃度乙醇∶二甲苯進行脫水處理，石蠟∶二甲苯 60 ℃孵育，100%石蠟繼續孵育。脫 蠟、包埋、切片、染色、顯微鏡觀察葉肉細胞。

1.3 數據統計分析

應用 Excel 2007 進行數據計算和作圖，用 DPS9.01 軟件進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 黃瓜皺葉突變體形態學調查

由圖 1 可以看出，與野生型植株相比，黃瓜皺葉突變體表現為葉片皺縮、葉基部沿凹陷處緊靠攏，花器官皺縮、株型緊湊，植株長勢正常且表型穩定。

由表 1 可以看出，在結果盛期，突變體與野生型相比，葉長、葉寬差異不顯著，但葉面積差異顯著，突變體葉面積顯著大于野生型，達 21.10%。突變體與野生型節間長、葉柄長、節數差異不顯著，但株高差異顯著，突變體株高顯著低于野生型，達11.0%。突變體株幅、葉柄著生角度均極顯著小于野生型，分別達 16.0%和 60.10%。突變體雄花花冠直徑、雄花花瓣長、雄花花瓣寬極顯著大于野生型，分別達 14.80%、13.30%和 33.30%。野生型與突變體相比，把瓜比差異極顯著，瓜長、瓜橫徑、腔徑比和可溶性固形物含量差異均不顯著。

2.2 黃瓜皺葉突變體葉綠素含量測定

由表 2 可以看出，與野生型相比，皺葉突變體植株葉綠素 a 含量顯著增加 ，比野生型提高了15.2%，而葉綠素 b、類胡蘿卜素 c 和葉綠素 a/b 的含量差異不顯著，突變體葉綠素 b 和類胡蘿卜素 c含量較野生型分別提高 14.6%和 15.6%，葉綠素 a/b較野生型提高 0.32%。

2.3 黃瓜皺葉突變體光合參數測定

由表 3 可以看出，黃瓜皺葉突變體 lc 的 Pn和 Tr均 顯 著 高 于 樂 亭 白 黃 瓜 ，分 別 提 高 28.40% 和30.40%，表明突變體光合能力強、葉片蒸騰速度快;突變體 Gs極顯著的高于樂亭白黃瓜，高達 38.60%; Ci差異不顯著，表明突變體和野生型對 CO2的利用率差異不大。

2.4 表皮細胞掃描電鏡觀察結果

由圖 2 可以看出，皺葉突變體的表皮細胞與野生型相比也呈現皺縮狀態，野生型葉表皮氣孔處于閉合狀態，突變體葉表皮氣孔部分處于開放狀態，相同視野下突變體的氣孔開放數目比野生型多。

2.5 表皮細胞石蠟切片觀察結果

由圖 3 可以看出，皺葉突變體葉片未皺縮部位的葉肉細胞較野生型葉肉細胞相近。突變體皺縮部位葉肉細胞較野生型葉肉細胞相比，海綿細胞變少，表皮細胞數目不變，葉片變薄，其中突變體葉肉厚度約為 186.8 μm，野生型葉肉厚度約為274.2 μm。

2.6 黃瓜皺葉突變體的遺傳規律分析

為了分析黃瓜皺葉突變體的遺傳規律，以皺葉突變體 lc 和野生型樂亭白黃瓜為親本，雜交獲得 F1 和 F1 反，F1和 F1 反植株均表現為野生型表型，表明突變性狀由隱性核基因調控。F1 代自交構建的 F2 代分離群體中，突變表型植株 52 株，野生型表型植株174 株 ，其分離比率為 3.35∶1（χ2=0.377<χ2（0.05，1）= 3.84），基本符合孟德爾遺傳規律的理想分離比 3∶1 （表 4），因此黃瓜皺葉突變基因為單隱性核基因，命 名 Cslc。

3 討論與結論

近年來，與植物葉片皺縮突變體相關的研究相繼被報道，目前已在多種高等植物中發現了葉片皺縮突變體，如煙草[15]、水稻[19- 20]、膏桐[21]、大豆[22]、甘 藍[23]、棉花[13，24]。

目前，黃瓜中皺葉突變體未見報道，但黃瓜超級緊湊或矮化突變體[25-26]、大豆葉片黃化新突變體[27]等均伴隨葉片皺縮表型。在本試驗中，黃瓜皺葉突變體為自然突變材料，該突變體表現為葉片皺縮、株型緊湊且植株長勢正常。筆者發現了一份新的皺葉突變體材料，在生產上可以利用其株型緊湊的優點進行合理密植。同時，突變體 lc 的發現豐富了葉形突變體的種質資源，也為黃瓜株型的改良提供了重要的材料。

葉片中葉綠素含量與凈光合速率密切相關[28]。在本試驗中，皺葉突變體植株葉綠素 a 含量顯著高于野生型植株，突變體的葉綠素 a 含量比野生型提高了 15.20%，而葉綠素 b、類胡蘿卜素 c 的含量和葉綠素 a/b 的值在兩親本間無顯著差異，但突變體葉綠素 b 和類胡蘿卜 c 含量較野生型分別提高14.60%和 15.60%。葉綠素含量測定結果與光合指標測定結果一致，黃瓜皺葉突變體 lc 的 Pn 顯著高于野生型，提高了 28.40%?？梢岳猛蛔凅w株型緊湊和光合速率高的優點配制雜交組合，為后期進行新品種選育奠定材料基礎。

不同物種中皺葉突變體已被廣泛研究，產生皺葉的原因也各不相同。本試驗通過掃描電鏡和石蠟切片觀察野生型和突變體的葉片變化，發現皺葉突變體的表皮細胞與野生型相比也呈現皺縮狀態，野生型葉表皮氣孔處于閉合狀態，突變體葉表皮氣孔部分處于開放狀態;皺葉突變體葉片未皺縮部位的葉肉細胞與野生型葉肉細胞，細胞形態相似，差異不大，但是皺葉突變體葉片的皺縮部位葉肉細胞比野生型薄，皺葉突變體的海綿層細胞數目比野生型少。突變體 lc 的葉片皺縮表型是海綿細胞數目變少導致的，這一研究結果與其他物種產生皺縮的原因不同[14，29-30]。

目前，國內外尚未見到關于黃瓜皺葉突變體商品瓜性狀研究的相關報道，突變體 Cslc 的發現為研究黃瓜商品瓜性狀提供了良好的種質材料。在本試驗中，野生型與突變體相比，把瓜比差異極顯著，瓜長、瓜橫徑、腔徑比和可溶性固形物含量差異不顯著。但由于試驗前期筆者關注更多的是生理指標和光合指標，因而沒有對商品瓜進行測產。將在今后的試驗中關注商品瓜產量，以期獲得更豐富的數據，進而進一步闡釋兩者間的差距。

現有研究表明，大部分作物中皺葉突變體是受一對隱性核基因控制的，如水稻[12]、玉米[14]、白菜[30]、棉花[13，31]等;但也有受不完全顯性核基因[32]、顯性基因控制的[9，33-34]。本試驗中的黃瓜皺葉突變體為自然突變，遺傳分析表明，突變體受一對隱性核基因控制，這與大多數皺葉突變體的遺傳規律相一致。黃瓜基因組測序和相關功能基因注釋已完成，有助于推動該基因的定位、克隆及其突變機制的進一步研究。

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