撳針療法對慢阻肺模型大鼠氣道形態學及氧化水平的影響

賀建豪，黃培煒，許金森，陳 銘

（1.福建中醫藥大學針灸學院，福建 福州 350108；2.福建省中醫藥科學院經絡研究所，福建 福州 350003；3.福建衛生職業技術學院醫學系，福建 福州 350101）

慢性阻塞性肺疾?。ê喎Q慢阻肺）是以不完全可逆性氣流受限為特征的呼吸道疾病，其臨床特征包括慢性呼吸系統異常、肺結構異常、肺功能受損，且通常還會伴有其他多器官功能紊亂［1］，主要癥狀是呼吸困難、慢性咳嗽、咳痰［2］。慢阻肺目前居我國疾病死亡原因的第3位［3］，預計到2030年慢阻肺將成為全世界發病率和病死率的第四大病因［4］，其高患病率、高死亡率和較重的經濟負擔已成為我國及全球重要的公共衛生問題［5］。撳針作為一種傳統干預方式，安全有效，目前國內已有一些臨床研究證實在西藥治療基礎上輔助撳針治療可以更好地改善慢阻肺患者癥狀［6-7］，但相關基礎研究較少。鑒于此，本文采用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）聯合煙熏建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型，觀察撳針“肺俞”穴對慢阻肺大鼠的氣管、肺組織形態學及血清、肺組織超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量的影響，初步探討撳針治療慢阻肺的機理，為臨床使用撳針提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物與儀器 18只雄性SD大鼠購自上海斯萊克實驗有限責任公司，體質量（180±20）g，9周齡，清潔級，許可證及合格證號碼分別為：SCXK（瀘）2017-0005，20170005006824。自制氣管滴管；自制煙熏箱（100 cm×80 cm×50 cm）；DNP-9162型恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；多功能酶標分析儀（瑞士帝肯公司，型號：Infinite F50）；L660低速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；YT-7FB型生物組織攤烤片機、ZT-14V2型組織脫水機、YB-7LF型包埋機均購自孝感市亞光醫用電子技術有限公司；RM2255型石蠟切片機（德國萊卡公司）。

1.1.2 材料與試劑 白色七匹狼牌香煙（福建中煙工業有限責任公司，每支含一氧化碳13 mg、煙堿0.9 mg、焦油量12 mg）；LPS（中國生物檢驗檢定所，規格：100 mg，批號：S09M10I87813）；一次性使用無菌撳針（吳江市云龍醫療器械有限公司，規格：0.25×2.0 mm）；4%多聚甲醛（蘭杰柯科技有限公司）；MDA、SOD檢測試劑盒（均購自上海酶聯生物科技有限公司，貨號分別為ml077384、ml001998，批號均為03/2021）。

1.2 方 法

1.2.1 分組及模型制備 SD大鼠適應性喂養1周，按隨機數字表分為正常組、模型組、撳針組，每組6只。后兩組采用LPS氣管內滴注+煙熏的方式造模［8］。造模方法：造模第1日用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，采用自制氣管插管，氣管內滴注1 mg/mL的LPS溶液，0.2 mL/只，休息1周。第2周開始置于煙熏箱，首先一次性點燃15支白色七匹狼香煙后放入煙熏箱內，關閉煙熏箱，每次30 min，每天1次，連續熏4周；繼而進行第2次氣管滴注1 mg/mL的LPS溶液，0.3 mL/只。休息1周后，用20支香煙熏4周，每天1次，每次30 min。造模共耗時10周，其中LPS滴注2次，休息2周，煙熏8周。正常組大鼠于相同時間點暴露于空氣中。

1.2.2 干預 于造模第8周開始對雙側“肺俞”穴進行干預，將腧穴部位及其周圍去毛，定位“肺俞”穴［9］，將撳針刺入“肺俞”穴，按揉“肺俞”2 min，每隔30 min按揉1次，共循環4次，總按揉時間為8 min，其余時間用膠布固定撳針，1次/d，每周干預6 d，連續干預3周，取針時一手固定大鼠，另一手用鑷子將膠布向外撕下。模型組除無撳針干預以外，其他都與撳針組相同。

1.2.3 觀察指標 干預結束次日，采用10%水合氯醛麻醉大鼠，切開腹部，用紗布撥開組織找到腹主動脈，用采血針進行腹主動脈采血，離心取上清液，存于-80℃冰箱待用；取右側固定位置的一塊肺組織，低溫冷凍破碎，以0.1 mg樣本加1 mL預冷PBS重懸，2～8℃，12 000RPM，離心取上清液存于-80℃冰箱，待用ELISA法檢測SOD及MDA，嚴格遵照試劑盒中說明書操作。取氣管、左側固定邊緣位置的肺組織，將其浸泡于4%的多聚甲醛中固定，在光學顯微鏡下觀察經過脫水、包埋、切片等過程后的氣管及肺組織病理改變并拍攝圖片。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，如果3組數據均符合正態性分布，則選擇單因素方差分析；如果3組中有一組數據不符合正態性分布，則選擇秩和檢驗；分析結果均以均值±標準差（±s）來表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠氣管、肺組織病理形態學

正常組大鼠氣管黏膜上皮完整（表面平滑），纖毛細胞游離面的纖毛未見異常；與正常組比較，模型組大鼠氣管黏膜上皮細胞增厚（表面毛糙），纖毛細胞增多，纖毛長度變長；與模型組比較，撳針組上皮細胞無明顯增厚（表面較平滑），纖毛細胞少，纖毛長度短。正常組大鼠肺泡結構未見異常，肺泡壁結構較完整，極少量炎性細胞浸潤；與正常組比較，模型組大鼠肺內肺泡間隔破裂融合形成肺大泡，肺泡腔明顯擴張，肺間質內見炎性細胞浸潤；與模型組比較，撳針組大鼠肺中融合的肺大泡數量減少，肺間質內炎性細胞浸潤減少。結果見圖1。

圖1 各組大鼠氣管、肺組織病理圖

2.2 各組大鼠血清、肺組織中SOD、MDA含量

與正常組比較，模型組大鼠血清、肺組織MDA含量增加（P＜0.05，P＜0.01）；肺組織SOD含量下降（P＜0.01）；與模型組比較，撳針組大鼠血清MDA含量下降（P＜0.01）、肺組織SOD含量增加（P＜0.05）。結果見表1。

表1 3組大鼠血清、肺組織SOD和MDA含量比較 （±s）

表1 3組大鼠血清、肺組織SOD和MDA含量比較 （±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與模型組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01

組別n 血清肺組織SOD（ng/mL）MDA（nmol/mL）SOD（ng/mL）MDA（nmol/L）正常組6 9.766±0.879 5.478±0.101 11.045±0.420 4.737±0.391模型組6 9.102±0.634 5.908±0.1692）9.944±0.7262）5.141±0.1921）撳針組6 9.271±0.521 5.532±0.1264）10.942±0.6273）5.138±0.192 F值1.480 18.079 6.063 4.300 P值0.259 0.000 0.012 0.033

3 討論

慢阻肺屬中醫學“肺脹”“咳嗽”“喘證”等范疇，常累及肝、脾、腎等臟，病機為本虛標實，急性期以標實為主，慢性期以本虛為主。糖皮質激素霧化吸入、長期吸氧、支氣管擴張劑等對癥支持治療是目前主要的治療方法，但是這些藥物長期使用會帶來感染、心血管事件等不良反應。盡管現代醫學在考慮如何使用藥物治療慢阻肺時盡可能減少副作用，但仍未找到解決此問題的方法［10］。

撳針長度較短，約為2～2.5 mm，只觸及皮下，不達深部，也不損傷大血管、神經，是一種安全、有效的干預方式，適用于需要長時間留針的慢性疾病。撳針療法的相關理論來源于《黃帝內經》中關于浮刺及《靈樞·官針》中關于久留針的論述，是十二皮部理論、衛氣理論、經絡腧穴學說、針刺理論共同指導下的實際應用［11］?！夺樉募滓医洝份d：“肺氣熱，呼吸不得臥，上氣嘔沫，喘氣相追逐，胸滿脅膺急，息難，肺俞主之……肺脹者，肺俞主之?！薄端貑枴た日摗吩唬骸爸闻K者，治其俞?！狈斡嵫ㄗ鳛樽闾柊螂捉浀囊粋€重要穴位，在臨床和科研中應用頻繁。肺俞穴為肺氣所轉輸、輸注的部位，與肺臟相應。當肺部有疾時，肺俞穴處會出現敏化現象，此時刺激此穴可以達到調節肺臟氣血的作用，損有余而補不足，維持人體氣血陰陽動態平衡［12］。有臨床研究表明撳針肺俞聯合八珍湯可降低患者TNF-α含量、升高IL-10含量，并且能提高6 min行走距離，明顯改善慢阻肺所引起的各種臨床癥狀［13］。

LPS聯合煙熏是一種耗時長的造模方法，可以成功制作慢阻肺模型。LPS是空氣污染物中革蘭氏陰性菌細胞壁的一個組成部分，細菌侵入生物體后，其細胞壁的LPS觸發單核細胞、巨噬細胞釋放炎性因子，在氣道和肺組織中誘發炎癥反應。香煙燃燒后會產生較高濃度的氧化產物和氧自由基，通過不同途徑刺激肺部產生炎癥，導致大量中性粒細胞和巨噬細胞往肺部和氣道遷移。中性粒細胞會釋放基質金屬蛋白酶（MMP）-8、MMP-9、彈性蛋白酶（NE）等，它們對肺泡組織有破壞作用。NE和MMP-9會降解彈性蛋白、膠原蛋白等多種細胞外基質成分；MMP-8擁有膠原酶活性，可以破壞肺泡間隔的正常結構，而間隔細胞的正常功能是保持肺泡結構完整性的前提。巨噬細胞中檢測到的巨噬細胞彈性蛋白酶（MMP-12）可以降解彈性蛋白，形成的片段會趨化單核細胞和成纖維細胞，從而促進炎癥反應，加速肺組織結構破壞［14］。纖毛細胞是氣管黏膜上皮的組成成分之一，呈柱狀，游離面有纖毛，當纖毛快速擺動時，可將黏液及附在其上的細菌、塵埃推向咽部，經咳嗽反射咳出，以凈化吸入的空氣，長期吸煙可使纖毛變形、膨脹［15］。通過上述形態學的結果可知，模型組大鼠的氣管黏膜上皮增厚，纖毛細胞增多，纖毛變長，肺泡間隔破裂，有炎性細胞浸潤。而撳針肺俞可以使氣管、肺組織的病理改變減輕，說明撳針肺俞穴可以在一定程度上治療慢阻肺。本研究造模時間較長，因為課題組前期預實驗發現停止煙熏后大鼠自行恢復速度較快，會影響撳針干預慢阻肺大鼠效果的判斷。

氧化/抗氧化失衡是慢阻肺發生的重要機制之一，生理狀況下人體內的氧化劑與抗氧化劑處于動態平衡，當二者處于不平衡時會出現氧化應激反應，導致細胞死亡和組織損傷。肺臟因其擁有豐富的血供和呼吸膜面積大等獨特的組織結構特點，極易受到活性氧（ROS）、活性氮（RNS）及脂質過氧化產物等內源性氧化劑的損害［16］。MDA可間接反映細胞受損害的程度，是脂質過氧化的標志，因其由ROS和不飽和脂肪酸反應分解而來，可交聯機體內大分子如蛋白質、核酸和脂類，引起生物膜變性，致使細胞死亡［17］。SOD是內源性抗氧化劑中的一種抗氧化酶，也是一種金屬活性酶，它可消除超氧陰離子自由基，阻止細胞核氧化裂解，進而防止生物細胞損傷凋亡［18］。

由表1可知，與正常組比較，模型組大鼠血清SOD含量有下降趨勢，肺組織SOD含量顯著下降，推測是香煙燃燒后產生的大量氧自由基首先被大鼠吸入肺部，機體啟動保護反應，肺中SOD因要消除大量氧自由基而比血液中消耗更多；模型組大鼠肺組織MDA含量上升，血清MDA含量顯著上升，說明機體存在肺部及血液中細胞受損害的情況，且血液中細胞受損害更嚴重，推測是肺中大量消耗的SOD清除了一部分氧自由基，減少了肺部細胞的損傷。與模型組比較，撳針組大鼠肺組織MDA含量變化不大，肺組織SOD含量上升，說明撳針可以增加肺中SOD含量以更多的消耗香煙產生的氧自由基，有效防止肺部細胞進一步損傷。血清MDA含量顯著下降，SOD有上升趨勢，說明撳針可以有效減輕血液中的細胞受損傷程度。綜上所述，我們可知撳針可以在一定程度改善機體氧化/抗氧化失衡狀態。

慢阻肺公認的發病機制除氧化-抗氧化失衡外，還有炎癥機制、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、自身免疫性疾病以及最新的細胞凋亡學說等，目前僅依靠一種機制不足以解釋慢阻肺的復雜病理，不同機制之間可能發生相互作用，比如氧化應激可以引起蛋白酶抗蛋白酶失衡、放大炎癥、引起自身免疫反應［19］，后續筆者將繼續觀察撳針肺俞在抗炎及糾正蛋白酶-抗蛋白酶等方面的作用，為臨床應用撳針提供實驗依據。