多指標-響應曲面法優選連翹中抗痤瘡有效部位的提取工藝研究

李思思，遆安航，譚麗媛，翟康欣，張淑蓉

（山西中醫藥大學，山西 晉中 030619）

連翹為木樨科植物連翹［Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl］的干燥果實，傳統中醫學認為連翹具有消腫、清熱、散結等作用，素有“瘡家圣藥”之稱?！斑B翹主治一切炎性疾患，如癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒、風熱感冒、溫病初起、溫熱入營、高熱煩渴、神昏發斑、熱淋澀痛等［1］”?，F代藥理研究發現其具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、解熱等藥理作用［2-3］，得益于連翹中含有的苯乙醇苷類、木脂素類、萜類、黃酮類等多種類型的化合物。痤瘡好發于青少年，丙酸桿菌是痤瘡發生的致病菌之一，抗菌治療是抗痤瘡的必要手段。氧化應激是由于細胞中產生了過多的活性物質，如活性氧簇和活性氮簇，超過抗氧化物的清除能力，導致了大分子生物（糖、脂質及與蛋白質）的氧化，氧化應激反應是引發痤瘡的重要因素，所以抗氧化也是治療痤瘡的有效措施［4］。本試驗選擇兼具抗菌、抗氧化的連翹酯苷B、連翹酯苷A、蘆丁為參考指標，以HPLC法為檢測手段，考察不同溶劑、不同提取時間、提取次數、溶劑加入量對連翹抗痤瘡有效部位提取工藝的影響，使用Box-Behnken響應曲面法對提取工藝進行優化，最終確定最佳提取工藝，為后續制備連翹抗痤瘡洗護用品提供參考和依據。

1 儀器與試藥

Waters e2695型高效液相色譜儀；MF204十萬分之一天平（瑞士梅特勒托利多公司）；FA224千分之一電子天平（上海舜宇科學儀器有限公司）；HDM-500數顯電熱套（金壇杰瑞爾電器）。連翹藥材采自山西太原汾河公園（蒸制30 min后在60℃以下烘干），經山西中醫藥大學裴香萍教授鑒定為《中國藥典》收錄品種；連翹酯苷B對照品（批號111810-201907）、連翹酯苷A對照品（批號161079-160828）、蘆丁對照品（批號161153-160831）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲酸（色譜純，天津市光復科技發展有限公司）；無水乙醇（分析純，天津市北辰方正試劑廠）；甲醇（色譜純，天津市天力化學試劑有限公司）；娃哈哈純凈水（娃哈哈集團有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗色譜條件

色譜柱BDSHYPERSIL C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫，程序見表1。HPLC流速1.0 mL/min，柱溫為25℃，檢測波長為270 nm，進樣體積為10μL。

表1 梯度洗脫條件

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取連翹酯苷B、蘆丁和連翹酯苷A對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含連翹酯苷B對照品0.227 mg/mL、連翹酯苷A對照品0.766 mg/mL和蘆丁對照品0.318 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 使用萬分之一天平量取連翹20 g，并置于圓底燒瓶中，精密加入60%乙醇溶液280 mL并稱定重量，加熱回流2.5 h，使用3層紗布濾過，按以上步驟重復操作3次，合并濾液，確定濾液體積，使用移液管將濾液精密量取1 mL置10 mL量瓶中，使用60%乙醇進行定容，搖勻，濾過，將續濾液用0.45μm微孔濾器過濾，得到供試品溶液。

2.3 測定法

精密吸取2.2.1項下對照品溶液、2.2.2項下供試品溶液各10μL，使用2.1項下色譜條件對其進行測定，結果見圖1、圖2。由圖可知，各成分峰形對稱，分離度良好。

圖1 混合對照品溶液HPLC圖

圖2 連翹HPLC圖

2.4 線性關系考察

分別精密稱取連翹酯苷B、連翹酯苷A和蘆丁對照品8.04 mg、3.57 mg、4.22 mg，置于10 mL的容量瓶中，加入甲醇使其溶解，稀釋至刻度并且搖勻，作為混合對照品母液。分別精密量取1mL、2mL、3 mL、4 mL、5 mL置于不同的10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得不同濃度的對照液，按上述色譜條件測定峰面積。以各有效峰的面積（Y）為縱坐標，對照品的濃度（C，μg/mL）為橫坐標，得連翹酯苷B線性方程為：Y=5565X+213 887（r=0.9998）、連翹酯苷A線性方程為：Y=5984.6X+50 282（r=0.9998）、蘆?。篩=16 086X+41 933（r=0.9999），分別在0.1054～0.817 mg/mL、0.332～1.665 mg/mL、0.0836～0.453 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液，分別按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，對各峰面積進行測定，計算得連翹酯苷B、連翹酯苷A和蘆丁的RSD值分別為0.56%、0.95%、0.73%，均小于3%。表明該儀器的精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批次連翹藥材6份，按供試品制備項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件對其進行含量測定。結果表明連翹酯苷B、連翹酯苷A和蘆丁的RSD值分別為2.74%、2.35%、2.83%。說明該方法有良好的重復性。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下同一供試品溶液10μL，于0 h、2 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h分別進樣，按上述色譜條件測定，結果顯示連翹酯苷B、連翹酯苷A和蘆丁含量的RSD值分別為0.1%，0.01%，0.04%。結果顯示供試品溶液在30 h內具有良好的穩定性。

2.8 加樣回收試驗

精密量取2.2.2項下已知濃度的連翹提取液0.5 mL各6份，分別加入一定量的對照品溶液，按含量測定項下的方法進行操作，測定連翹藥材中各成分的平均回收率和RSD值。試驗結果顯示連翹提取液中連翹酯苷B、連翹酯苷A和蘆丁的平均回收率分別是99.6%、100.8%、99.7%，RSD值分別是0.77%、1.08%、0.61%。說明該方法具有良好的準確度。

2.9 單因素考察

以連翹酯苷B、連翹酯苷A、蘆丁含量的綜合評分值［1］（Y）為評價指標［Y=（連翹酯苷B含量/連翹酯苷B含量max）×30%+（連翹酯苷A含量/連翹酯苷A含量max）×40%+（蘆丁含量/蘆丁含量max）×30%］，對提取溶媒（水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、100%乙醇）、不同煎煮時間（0.5、1、2、2.5、3 h）、提取溶媒加入量（6、8、10、12、14、16倍量）進行考察，考察結果見圖3～5。

圖3 不同提取溶媒考察結果

圖4 溶劑加入量考察結果

圖5 提取時間考察結果

根據單因素考察結果，在進行Box-Behnken響應曲面分析時，提取溶媒選擇60%乙醇，提取時間選擇1.5 h、2 h、2.5 h；在溶劑加入量選擇中，由于單因素考察中14倍量至16倍量Y值變化不大，綜合考慮成本問題，選用10倍、12倍、14倍溶劑加入量作為考察指標；提取次數一般不超過3次，所以選用1次、2次、3次為考察指標。

2.10 Box-Behnken響應曲面法

以煎煮次數（A）、溶劑加入量（B）和提取時間（C）為影響因素進行考察，以連翹酯苷B、連翹酯苷A和蘆丁綜合評分值（Y）為評價對象，設計3因素3水平共17組試驗。因素水平表見表2，試驗設計與結果見表3，方差分析見表4。由表4可知，因素A有極其顯著的影響（P＜0.01），因素B與A2均具有較顯著的影響（0.01＜P＜0.05）?；貧w方程 為Y=86.31+11.77A+3.99B+2.30C+1.79AB-1.06AC+0.6675BC-4.91A2-2.39B2+3.13C2。相關系數r=0.9656，擬合情況良好。調整相關系數r=0.9195，可以解釋91.95%響應值的變化，可以用于預測分析［5-7］。

表2 因素水平表

表3 試驗設計與結果

通過Design Expert軟件對表4數據進行響應面分析，結果見圖6。其中圖a（固定煎煮時間不變）顯示，煎煮次數不變時，隨著料液比增大響應值一直趨于平穩；料液比不變時，隨著煎煮次數增加，響應值先升高后趨于平穩（煎煮2～3次時響應值最高）。圖b（固定料液比不變）顯示，煎煮次數不變時，隨著煎煮時間增長，響應值趨于平穩；煎煮時間不變時，隨著煎煮次數增多，響應值先上升后趨于平穩（煎煮時間為2～2.5 h，煎煮3次時響應值最高）。圖c（固定煎煮次數不變）顯示，料液比不變時，隨著煎煮時間延長，響應值趨于平穩；煎煮時間不變時，響應值緩慢升高（料液比為1∶14時，響應值最高，而煎煮時間影響不大）。綜上所述，直觀得出結論煎煮時間為2.5 h，煎煮3次，料液比為1∶14時為最優工藝。軟件所得最佳提取工藝與直觀一致［2］。

表4 方差分析

圖6 響應曲面圖

2.11 驗證試驗

對Design-Expert軟件所得的優化工藝進行驗證試驗（n=3），結果見表5。最終確定提取工藝為用60%乙醇提取，提取3次，每次2.5 h，料液比為1∶14。

表5 驗證試驗結果

3 討論

痤瘡在青少年中發病率極高，且容易復發，不僅對患者的外貌造成影響，還會嚴重影響到青少年的心理健康和生活質量。連翹被稱之為“瘡家圣藥”，現代藥理實驗發現其具有確切的抗菌作用［8］。本課題組前期試驗采用薄層自顯影技術對連翹中的熊果酸、連翹酯苷A、齊墩果酸、蘆丁、連翹苷進行抗氧化活性成分篩選［3］，見圖7。結果發現連翹酯苷A、蘆丁具有明顯的抗氧化作用。在連翹藥材薄層自顯影中，與連翹酯苷A對照相應的位置，顯色斑點較大，結合HPLC色譜圖，分析其可能為連翹酯苷A與連翹酯苷B未分離開的共同斑點；且通過連翹酯苷B對照品與顯色試劑反應，證實連翹酯苷B也具有抗氧化作用。故實驗選用兼具抗菌、抗氧化的連翹酯苷A、連翹酯苷B、蘆丁等3種成分為考察指標進行抗痤瘡有效部位的篩選。

圖7 連翹抗氧化活性成分篩選

實驗采用多指標-響應曲面法確定的連翹中抗痤瘡有效部位的提取條件為：提取溶媒60%乙醇，提取3次，每次2.5 h，溶媒加入量為14倍量。提取工藝簡便、易于操作，且專屬性強，可為后續開發連翹抗痤瘡洗護用品提供技術依據。