超聲結合WES對Treacher Collins綜合征胎兒的產前診斷

李榮 林曉瑩 吳曉昀 黃呈 毛邱嫻 魏佳雪*

(1.廣東省第二人民醫院 產前診斷中心，廣東 廣州 510317；2. 廣東省第二人民醫院 檢驗醫學部，廣東 廣州 510317)

Treacher Collins綜合征(Treacher Collins syndrome，TCS；OMIM#154500)又稱之為下頜面骨發育不全(mandibulo facial dysostosis，MFD)，主要是顱面發育障礙[1,2]。這些特征包括顴骨發育不全、下瞼裂、耳廓畸形、下頜骨發育不全、巨裂、具有特殊的“魚樣面”面容，發病率比較低，為1/50 000左右[3]，該病約40%有家族史，而有60%的為散發病例[4]。TCS具有遺傳異質,OMIM數據庫將該病分為1～4型，大多數TCS患者(占78%～93%)是由TCOF1基因突變引起的TCS-1(OMIM#154500)，與常染色體顯性遺傳性單倍體功能不全相關。由POLR1D基因突變引起的TCS-2(OMIM 613717)既可以是常染色體顯性遺傳，也可以是隱性遺傳。由POLR1C基因突變引起的TCS被歸類為TCS-3(OMIM#248390)，該類型為常染色體隱性遺傳[5-7]。而在最近的一項研究中，POLR1B被發現是一種新的致病基因，與一種新型的TCS-4(OMIM#618939)有關[8]。TCOF1基因所編碼的核仁磷酸化蛋白Treacle在TCS發生中發揮著不可或缺的作用。Treacle蛋白致病機制主要在于，TCOF1基因突變使其截短，從而引起蛋白功能喪失。研究發現，下調Treacle表達將抑制核糖體DNA基因轉錄，在神經嵴融合時不能產生足夠的核糖體RNA，從而引發的神經外胚層和神經嵴細胞增殖降低是畸形發生的直接原因[9,10]。本文對1例產前超聲提示小下頜合并外耳異常胎兒實行產前基因檢測，以明確其致病機理。

1 對象與方法

1.1 對象 孕婦，29歲，孕13周首診。G1P0，平素月經規律，自然受孕。否認不良接觸及近親結婚和家族遺傳病史。孕13周超聲檢查顯示: 胎兒如孕13周，頸項透明層厚度 (nuchal translucecy，NT)1.8mm，胎兒顏面部正中矢狀切面顯示異常，小下頜畸形待排，如圖1A。孕18周Ⅲ級產前超聲檢查顯示：胎兒顏面部正中矢狀切面顯示下唇及頦形成的曲線失常，頦稍后，下唇后移，下唇較上唇位置稍后，面下部角(inferior facial angle,IFA)41°，雙側外耳形態異常，位置可疑偏低，考慮小下頜畸形，如圖1B、C。

圖1 病例超聲圖像

1.2 方法

1.2.1 多重定量熒光PCR(quantitative fluorescence PCR，QF-PCR)快速診斷 采用Devyser 13、18、21-三體和性染色體非整倍體檢測試劑盒，通過熒光PCR毛細管電泳法進行分析。在提取羊水細胞基因組DNA并純化后，采用試劑盒對DNA模板進行多重熒光PCR擴增，取擴增產物1μl加入甲酰胺9μl與內標GeneScan Rox-500 Size standard(ABI)0.2μl，將待測96孔板放入ABI3500遺傳分析儀上進行片段分析，Genemapper 4.1系統進行定量分析。

1.2.2 染色體G顯帶核型分析 羊水細胞培養7d后進行傳代培養，2d后視細胞生長狀況進行收獲以及染色體制備，在顯微鏡下計數20個核型，分析5個核型。染色體核型描述按照人類細胞遺傳學命名國際體系(ISCN2016)。

1.2.3 染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis，CMA) 采用QIAamp DNA Blood Mini Kid(德國QIAGEN公司)提取基因組DNA并測定其濃度和純度，再通過限制性內切酶消化、加接頭、PCR擴增、片段化、生物素標記來構建芯片文庫。利用美國Affymetrix公司的CytoScanTM 750K芯片與生物素標記好的基因組DNA進行雜交檢測羊水細胞全基因組不平衡現象，結果采用Chromosome Analysis Suits(ChAs)軟件進行分析。

1.2.4 全外顯子測序(whole exon sequencing，WES)

1.2.4.1 文庫構建與測序 使用安捷倫(Agilent)的SureSelectHuman All Exon 50Mb平臺制備檢測樣本，包括DNA片段化、末端修復、加接頭、PCR擴增、探針雜交、磁珠捕獲富集等步驟。構建文庫使用安捷倫(Agilent)2200分析儀質控分析合格后采用illumina 550完成高通量測序。

1.2.4.2 生物信息學分析 利用FastQC軟件對原始數據進行質控分析；利用BWA軟件(v0.7.15-r1140)將所有過濾后的測序序列(reads)比對到參考基因組(GRCh37/hg19);利用Picard軟件工具去除重復reads；利用GATK軟件工具包(v3.7-0)完成單堿基變異和插入缺失變異的檢出；利用Annovar及VEP等軟件包進行注釋。

1.2.4.3 致病性變異過濾與篩選 結合人群dbSNP數據庫(SNP150)、千人基因組數據庫等信息，去除最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>0.01 (常染色體顯性遺傳病)或MAF>0.05(常染色體隱性遺傳病)的高頻變異。參考2020年廣東省精準醫學應用學會團體標準發布的《產前外顯子測序遺傳咨詢和報告規范》，結合結合疾病基因變異數據庫(Clinvar、HGMD數據庫、OMIM數據庫)信息、文獻報道、功能試驗、遺傳模式、基因型-表型關聯分析等綜合判斷，按照《ACMG遺傳變異分類標準與指南》將變異分成致病、可能致病、意義不明確、可能良性、良性5類；并篩選出與先證者表型相關的可疑致病性變異進行sanger測序驗證等進一步分析。

1.2.4.4 sanger測序驗證及家系共分離分析 通過以上方法篩選出的可疑致病基因變異，利用Primer5軟件設計引物進行PCR擴增及Sanger測序驗證。利用chromas軟件對測序數據分析。胎兒及父母家系DNA樣本測序結果進行家系共分離分析。

2 結果

2.1 QF-PCR結果分析 未見21號、18號、13號及性染色體數目異常，STR位點分析提示未見母體DNA污染。

2.2 染色體G顯帶核型分析及CMA分析結果 胎兒羊水染色體分析結果為46,XN，未發現核型異常。經CytoScanTM 750K芯片掃描及數據分析結果為[hg19](1-22)×2,(XN)×1，未發現致病性拷貝數變異、雜合性缺失及單親二倍體。

2.3 全外顯子測序結果分析 一家三口全外顯子測序(trio-whole exome sequencing，Trio-WES)檢出胎兒攜帶TCOF1 基因NM_001135243.1: exon8: c.928_931del:p.T310fs 雜合致病變異，對于該個體親本樣本中該區域的全外顯子測序分析未檢測到該變異，該變異在胎兒中為新發變異。本例胎兒TCOF1基因第8外顯子c.928-931del(p.T310fs)缺失突變尚未見文獻報道，胎兒、母親及父親Sanger驗證測序圖見圖2。

圖2 TCOF1基因變異Sanger測序驗證圖

2.4 胎兒妊娠結局隨訪 產前遺傳咨詢后，孕婦選擇終止妊娠，胎兒引產見圖3?？梢姷湫偷男∠骂M、外耳畸形等Treacher Collins綜合征癥狀。

圖3 胎兒引產后表型

3 討論

TCS是一種以常染色體顯性遺傳為主的先天性臉頰骨及下頷骨發育不全疾病。TCOF1基因作為TCS主要致病基因(78%～93%)，現已發現超過300種突變，它們既可自發產生，也可由遺傳獲得，沒有明顯的性別差異。TCS畸形與其他顱面部疾病不同，除一些軟組織和骨骼外通常是雙側對稱發病，累及部位自上而下主要包括眼及眶周、耳、顴骨顴弓和上下頜骨等，大腦、腎臟和四肢畸形很少見。顴骨復合體(81%)和上下頜骨(78%)發育畸形是TCS最明顯的特征[11]。Vincent等[12]將TCS1患者的臨床特征與文獻報道的患者進行了比較。在70例患者中，眼瞼裂向下傾斜(100%)、顴骨發育不良(99%)、傳導性耳聾(91%)、下頜發育不良(87%)、外耳道閉鎖(72%)、小耳(71%)、下瞼缺損(65%)、不對稱(53%)、頭發向側頰突出(48%)、腭裂(22%)、后鼻孔狹窄/閉鎖(14%)、心臟畸形(12%)?？梢娫摷膊〉耐怙@率比較高但表型差異很大，表型較輕者幾乎未顯現明顯的臨床特征，而表型較重者可因鼻后孔閉鎖、舌后墜等原因導致通氣障礙而死亡[13]，這些因素給TCS患者，特別是產前胎兒的明確臨床診斷和遺傳咨詢帶來了困難。目前，產前TCS可以通過常規的二維超聲或更精細的三維掃描來檢測；但對于輕到中度的TCS，尤其是散發性TCS，很少有效[14]。因此，識別受累胎兒的致病基因對準確預防TCS具有重要意義。本文胎兒在孕早期13周超聲檢查即出現了疑似小下頜待排，繼續超聲監測在18周發現明顯小下頜畸形、外耳形態異常、耳低位等面部發育不良。通過全外顯子測序，發現胎兒TCOF1 基因第8外顯子存在c.928-931del(ACCC)(p.T310fs)雜合突變，依據美國醫學遺傳學會(American College of Medical Genetics，ACMG)遺傳變異分類標準與指南[15]，致病變異標準可分為非常強(very strong，PVS1)、強(strong，PS1-4)、中等(moderate，PM1-6)、或輔助證據(supporting，PP1-5)。良性變異證據可分為獨立(stand-alone，BA1)、強(strong，BS1-4)、或輔助證據(BP1-6)。其中，數字只是作為有助于參考的分類標注，不具有任何意義。每個類別中的數字不表示分類的任何差異，僅用來標記以幫助指代不同的規則。本例胎兒TCOF1 基因c.928-931del(ACCC)(p.T310fs)證據項為PVS1+PM2+PP4，判斷該變異為致病變異，證據為，PVS1：當一個疾病的致病機制為喪失功能(loss of function, LoF)時，無功能變異(無義突變、移碼突變、經典±1 或 2 的剪接突變、起始密碼子變異、單個或多個外顯子缺失)。PM2：ESP 數據庫、千人數據庫、EXAC 數據庫中正常對照人群中未發現的變異(或隱性遺傳病中極低頻位點)；人群頻率：ESP6500：-，千人：-，EXAC：-，GnomAD：-。PP4：變異攜帶者的表型或家族史高度符合某種單基因遺傳疾病。本文胎兒采用Sanger測序進行驗證結果與WES一致，該突變使得終止密碼子提前出現，可能會導致Treacle蛋白截短而喪失功能，這與單倍性不足的機制是一致的符合證據項PVS1；胎兒父母在該區域的全外顯子測序分析未檢測到該變異，該變異在胎兒中為新發變異，且該突變類型尚未見文獻報道，符合證據項PM2；胎兒表型與TCS表型高度符合,判定為PP4證據項，綜合上述證據項診斷本例胎兒TCOF1 基因c.928-931del(ACCC)(p.T310fs)變異是導致TCS的致病性變異。該TCS患兒的產前診斷為該家系的遺傳咨詢提供了重要信息。

目前為止，根據人類基因突變數據庫(The Human Gene Mutation Database，HGMD)的數據，在TCS患者中已經報道了300多種不同的TCOF1基因突變。目前已發現的突變種類包括框移突變、剪切突變、無義突變和缺失突變等，多數突變都引入了一個終止密碼子的過早插入。最常見的TCOF1基因變異是小缺失(60%)和重復(25%)導致的移碼突變[16]。國外報道認為TCOF1基因的5個外顯子(10、15、16、23和24)是TCOF1基因突變的熱點區域(50%)[17]，但其他外顯子的致病變異均有報道。目前產前基因診斷TCS的報道極少，中國人產前TCS基因診斷目前僅報道1例胎兒為新的TCOF1基因第2～6外顯子的大缺失，來源于胎兒父親，胎兒父親表現出明顯的斜眼瞼裂隙、眼瞼缺損、顴弓發育不良，屬于家系遺傳[18]。而本文胎兒父母表型均無異常，僅依靠超聲圖像不能做出診斷，需要通過WES分析從分子水平明確胎兒的致病機制。

目前治療TCS的首選方法仍是以改善患者外貌、提高患者生存質量的外科手術方法為主。但多學科的共同參與、有序的治療時間安排和完善的術前設計才是手術成功的保障。除手術治療外，p53基因治療和抗氧化劑治療也逐漸成為研究熱點，具體應用于臨床還需要更為完善的研究支持[19]。相較于手術治療給社會和家庭帶來的巨大經濟負擔以及在此期間疾病給患者造成的巨大心理傷害，TCS產前預防和篩查非常重要。在本文病例中，與其他具有不同突變的患者相比，我們并沒有發現特殊的表型。僅靠超聲篩查對TCS胎兒做出明確診斷仍具有挑戰性。分子診斷在TCS患者產前和產后階段發揮著重要作用，對遺傳咨詢的發展有著不可否認的影響。本文結合三維超聲和全外顯子組測序，成功地檢測了TCS胎兒。在該家系中發現了一個新的TCOF1基因第8外顯子c.928-931del(ACCC)缺失突變，擴大了HGMD數據庫TCOF1基因的突變譜。本研究還表明，面對類似的產前顱面畸形病例，分子遺傳學檢測有助于明確診斷，指導產前診斷后續的遺傳咨詢。