基于網絡藥理學探討炙甘草湯治療心律失常的作用機制

葉嘉豪　胡志?！＄娚堋∏窈辍⌒芟架?/p>

摘要 目的：運用網絡藥理學方法探討炙甘草湯治療心律失常的作用機制。方法：運用中藥系統藥理數據庫與分析平臺（TCMSP）和BATMAN-TCM數據庫，篩選出炙甘草湯有效成分及其作用靶點。通過GeneCards、OMIM數據庫篩選出心律失常的疾病靶點，并與中藥靶點合并取交叉靶點，采用String數據庫構建靶點蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，并運用Cytoscape 3.7.2篩選關鍵基因，同時借助CytoNCA插件進行拓撲分析;運用Bioconductor數據庫及RX64 4.0.0軟件對交集基因進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。利用swissdock在線分子對接工具對蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡中的核心蛋白與核心化合物分子進行分子對接。結果：篩選出171個化合物及4 090個靶點，得到關于心律失常疾病靶點435個;PPI結果顯示，Degree值排名前6的基因分別為：INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1、TNNI3;拓撲分析顯示Degree排名前5的基因分別為：EGFR、HSPA8、NTRK1、ESR1、HSP90AA1;分子對接結果顯示：炙甘草湯的大多數活性成分和關鍵靶點的結合率較強，其結合能最低為SCN5A與Lysine、KCNH2與Gamma-Aminobutyric Acid;GO富集分析顯示炙甘草湯治療心律失常與心臟收縮、心臟肌肉收縮、心的過程、橫紋肌收縮、心臟收縮調節等有關。KEGG富集分析顯示心肌細胞的腎上腺素能信號、肥厚型心肌病、cGMP-PKG信號通路、擴張型心肌病相關。結論：炙甘草湯治療心律失常具有多成分、多靶點、多途徑的特點。

關鍵詞 心律失常;炙甘草湯;網絡藥理學;靶點;通路;分子對接;作用機制

Mechanism of Zhigancao Decoction in Treatment of Arrhythmia Based on Network Pharmacology

YE Jiahao，HU Zhixi，ZHONG Senjie，QIU Hong，XIONG Xiajun

（Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Zhigancao Decoction in treating arrhythmia based on network pharmacology.Methods：The active ingredients and targets of Zhigancao Decoction were screened out from Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） and BATMAN-TCM，and the disease targets of arrhythmia were screened out through GeneCards and OMIM.The common targets of the drug and the disease were obtained.String was used to construct a protein-protein interaction（PPI） network of targets，and Cytoscape 3.7.2 was used to screen key genes，which underwent topological data analysis by CytoNCA plug-in.Bioconductor and RX64 4.0.0 were adopted for GO enrichment and KEGG pathway enrichment analyses of common genes.The core proteins were subjected to molecular docking with core compound molecules in the PPI network using SwissDock.Results：A total of 171 compounds and 4 090 targets were screened out，and 435 targets related to arrhythmia were obtained.PPI results showed that in terms of degree，the top 6 genes were INS，KCNH2，SCN5A，CAV3，GJA1，and TNNI3.Topological data analysis revealed that in terms of degree，the top 5 genes were EGFR，HSPA8，NTRK1，ESR1，and HSP90AA1.Molecular docking results showed that most of the active ingredients and key targets of Zhigancao Decoction had high binding rates，with the lowest binding energy of SCN5A to lysine and KCNH2 to γ-aminobutyric acid.GO enrichment analysis showed that the therapeutic effect of Zhigancao Decoction was related to heart contraction，heart muscle contraction，heart process，striated muscle contraction，and heart contraction regulation.KEGG enrichment analysis showed that the therapeutic effect of Zhigancao Decoction was associated with adrenergic signal in cardiomyocytes，hypertrophic cardiomyopathy，cGMP-PKG signaling pathway，and dilated cardiomyopathy.Conclusion：Zhigancao Decoction is characterized by multi-component，multi-target，and multi-pathway in the treatment of arrhythmia.

Keywords Arhythmia; Zhigancao Decoction; Network pharmacology; Target; Pathway; Molecular docking; Mechanism

中圖分類號：R289.5;R541文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.06.002

心律失常是由于各類心臟疾病所導致心律傳導異常的病變，具體表現為心律過速或心律不齊、心房顫動以及相關病變引發的全身性癥狀[1]?；颊叱Ｒ蛐穆墒С３霈F乏力、頭暈等癥狀;嚴重者會出現抽搐、暈厥、胸痛或氣促等現象，甚至會引起心源性猝死[2]。臨床上常用炙甘草湯治療心律失常，炙甘草湯出自《傷寒論》，具有益氣滋陰，通陽復脈之功效[3-4]。主治陰血陽氣虛弱，心脈失養證。脈結代，心動悸，虛羸少氣，舌光少苔，或質干而瘦小者;虛勞肺痿等。其由炙甘草、生姜、桂枝、人參、地黃、阿膠、麥冬、火麻仁、大棗組成?，F代研究表明，炙甘草湯具有效擴張血管，從而促進患者血液循環，改善心肌供血，同時能有效加強心臟收縮力的作用[5-7]?，F基于網絡藥理學及分子對接技術，探討炙甘草湯治療心律失常的分子作用機制，為臨床實驗提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 炙甘草湯化學成分篩選及潛在靶點靶點預測 運用中藥系統藥理數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）查找關于炙甘草湯的主要有效成分及靶點，篩選條件為口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）>30%及類藥性（Drug Likeness，DL）>0.18，檢索關鍵詞為：甘草、生姜、桂枝、麥冬、地黃、火麻仁、阿膠、大棗、人參;若在TCMSP中找不到相關中藥，則利用Batman-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php）查找有效成分及相關靶點，篩選條件為SCORE>20。

1.2 心律失常疾病靶基因的篩選 檢索GeneCard數據庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM數據庫（https：//omim.org/）篩選心律失常相關靶點，以“arrhythmia”為關鍵詞，Genecard選取相關性得分>10的靶點，通過合并去重后，最終獲得心律失?；虬悬c。

1.3 構建“中藥-活性成分-疾病”交集靶基因數據庫及其網絡圖 將炙甘草湯潛在靶點與心律失常靶點利用PERL軟件進行合并，剔除重復或無對應化學成分的靶點后，獲得炙甘草湯-心律失常共同靶點，利用Cytoscape 3.7.2（http：//www.cytoscape.org/）對其進行可視化，構建出“中藥-活性成分-疾病”基因網絡圖。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡及拓撲分析 將炙甘草湯-心律失常共同靶點導入String數據庫（https：//string-db.org/），種族選擇Homo sapiens，其置信度設置為0.4，進行靶點蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI），按照節點連接度（Degree）高低對靶點進行前后排序。利用Cytoscape 3.7.2軟件中的CytoNCA工具對靶點進行拓撲分析，按照節點度值（Degree）和中介中心度（Betweenness Centrality）的數值高低進行排序，在構建關鍵節點的子網絡上以Degree和Betweenness≥中位數為篩選條件，篩選核心靶基因。

1.5 富集分析 利用Bioconductor數據庫及RX64 4.0.0軟件對核心靶基因進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，物種選擇為人，閾值設定為P≤0.5，GO富集分析選擇生物過程（BP）、細胞組成（CC）和分子功能（MF）。

1.6 分子對接 從PDB數據庫（http：//www.rcsb.org/）下載PPI網絡中得分排名前4的蛋白結構，利用Pymol軟件移除配體和水分子;從PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中下載核心化合物的sdf文件，利用OpenBabel軟件將其轉化為mol2格式，將靶點蛋白及化合物分子運用swissdock（http：//www.swissdock.ch/）進行在線分子對接。配體與受體結合的構象穩定時能量越低，發生作用的可能性越大。當結合能絕對值>4.25表示分子與靶點具有一定的結合能力，>5.0表示結合能力較強，>7.0表示結合能力很強[8]。

2 結果

2.1 炙甘草湯活性成分篩選及靶點預測 根據篩選標準，共得出171個化合物，其中大棗16個、桂枝7個、火麻仁6個、人參22個、生姜5個、甘草92個，阿膠3個、地黃2個、麥冬18個，各中藥有效成分見表1。檢索出靶點為4 090個，其中大棗113個、甘草2 506個、桂枝73個、火麻仁139個、人參256個、生姜75個、阿膠418個，地黃205個，麥冬305個。

2.2 心律失常相關靶點 利用GeneCards、OMIM數據庫，以“arrhythmia”為關鍵詞，Genecard篩選標準為相關度Score>10，共獲得疾病靶基因435個，其中Genecard獲得257個，OMIM獲得178個。

2.3 “中藥-成分-疾病”網絡的構建 將炙甘草湯靶點與心律失常靶點導入Excel表進行對比分析，發現心律失常與炙甘草湯潛在靶點有44個重合。將結果導入Cytoscape軟件構建“中藥-成分-疾病”可視化網絡。靶點節點44個，化合物節點105個，共計149個，620條邊;化合物中度值前5為：Stigmasterol、Lysine、Gamma-Aminobutyric Acid、Fumarine、Licoagrocarpin;中藥-成分-靶基因網絡見圖1。

2.4 中藥-靶點相互作用網絡構建 將炙甘草湯-心律失常共同靶點導入string中。限定物種為人，設置置信度閾值≥0.4，隱藏網絡中不相關聯的節點。結果共涉及44個節點，198條邊，平均節度點為9.0，平均局部聚類系數為0.619。見圖2。采用RX64 4.0.0描繪出前30個靶基因的柱狀圖，并進行柱狀圖可視化。得到Degree排名前6為INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1、TNNI3。見圖3。

2.5 拓撲分析 將從string數據庫中得到的疾病與化合物交集基因PPI網絡圖導入Cytoscape，運用Cytoscape中的CytoNCA插件對其進行網絡拓撲分析，篩選條件為節點連接度（Degree）和節點介度

2.6 GO及KEGG通路富集分析 利用Bioconductor數據庫及RX64 4.0.0軟件對炙甘草湯作用的靶基因進行生物過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）的GO、KEGG通路富集分析，設定閾值為P≤0.05。

GO富集分析結果顯示：得到條目共728個，其中BP條目612條，CC條目48條，MF條目68條。BP主要與心臟收縮（Heart Contraction）、心臟肌肉收縮（Cardiac Muscle Contraction）、心的過程（Heart Process）、橫紋肌收縮（Striated Muscle Contraction）、心臟收縮調節（Regulation of Heart contraction）相關。CC主要與陽離子復雜通道（Cation Channel Complex）、收縮纖維（Contractile Fiber）、肌節（Sarcomere）、收縮纖維部分（Contractile Fiber Part）、肌原纖維（Myofibril）等通路相關。MF與電壓門控離子通道活性（Voltage-gated Ion Channel Activity）、電壓門控通道活動（Voltage-gated Channel Activity）、離子通道綁定（Ion Channel Binding）、頻道活動（Channel Activity）、被動跨膜轉運蛋白活性（Passive Transmembrane Transporter Activity）相關。

炙甘草湯治療心律失常主要富集的KEGG生物學通路有44條，其與心肌細胞的腎上腺素能信號（Adrenergic Signaling in Cardiomyocytes）、肥厚型心肌?。℉ypertrophic Cardiomyopathy）、cGMP-PKG信號通路（cGMP-PKG Signaling Pathway）、擴張型心肌?。―ilated Cardiomyopathy）等疾病相關。

對其結果進行可視化處理。見表2和圖7。條形圖X軸長度代表富集的基因數目，Y軸代表名稱，條形圖顏色代表富集程度;氣泡圖顏色代表富集程度，即P值大小;氣泡大小代表富集的基因數目。

2.7 分子對接 從PDB數據庫下載INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1的蛋白結構，運用Pymol軟件移除配體和水分子，由于數據庫中沒有搜索到CAV3，故未做分析;從PubChem數據庫中下載Fumarine、Gamma-Aminobutyric Acid、Licoagrocarpin、Lysine、Stigmasterin的小分子結構sdf文件，利用OpenBabel軟件將其轉化為mol2格式，將靶點蛋白及化合物分子運用swissdock進行在線分子對接。

結果顯示：對接得分均≤-5.0 kcal/mol（1 cal=4.184 J），炙甘草湯與預測的作用靶點有較好的結合，其結合能絕對值前2名分別為：SCN5A與Lysine、KCNH2與Gamma-Aminobutyric Acid，其結合能絕對值均大于8，說明其擁有較強的結合能力。分子對接分數見表3，分子對接見圖8～9。

3 討論

本研究基于網絡藥理學，篩選出炙甘草湯有效活性成分及靶點，系統研究了炙甘草湯對心律失常的干預作用及作用機制。通過PPI網絡分析，發現INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1、TNNI3。SCN5A與心肌動作電位的形成相關，其為心臟鈉離子通道同型異構體Nav1.5通道蛋白的基因，該基因與長QT綜合征、病態竇房結綜合征等發病相關[9-11]。CAV3具有調控心血管病發生發展的作用，如在膽固醇循環中，CAV能使膽固醇由包膜向內涵體轉運，從而起到抑制冠脈粥樣硬化的作用[12];當CAV3高表達時，會破壞心肌的結構與功能，從而引起心肌纖維化。KCNH2對平滑肌細胞興奮性調節具有重要作用，其突變可能會導致鉀離子流外流，動作電位時程和不應期不均一性縮短，形成短QT間期和增加易損性[13-14]。TNNI3基因編碼cTnI蛋白，而cTnI是組成肌鈣蛋白的成分之一，是心肌組織收縮的調節蛋白，研究表明，TNNI3在心力衰竭、心肌肥大、缺血再灌注及心臟電傳導中發揮一定作用[15-16]。

通過拓撲分析，發現EGFR、HSPA8、NTRK1、ESR1、HSP90AA1。表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）是一種受體型蛋白酪氨酸激酶，當其被激活時，其胞內酪氨酸激酶功能域發揮活性，通過復雜的生化級聯反應及信號傳遞，參與了體內許多重要的細胞生物過程如生長、分化、凋亡、黏附、遷移等[17]。研究顯示，EGFR激酶可能通過心肌例子通道的酪氨酸磷酸化參與心臟電生理的調控。雌激素受體（Estrogen Receptor，ER）與雌激素結合，其結合物具有調節兩類活性物質的生成和釋放的功能，如舒張血管物質：內皮依賴性舒張因子、依前列醇等;縮血管物質：內皮素、血管緊張素等;起到改善血管內皮功能，抑制炎癥、抗動脈粥樣硬化等作用[18]。熱激蛋白（Heat Shock Protein，HSP）是在應激情況下合成的蛋白。在保護心肺組織及中樞神經系統等免受內外源性損傷中發揮巨大作用，并對炎癥反應、腫瘤、自身免疫過程等具有重要的調控作用[19]。

分析對接結果顯示，INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1與炙甘草湯的物種核心化合物的對接能量均小于-5 kcal/mol，說明炙甘草湯的活性化學成分可以和INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1蛋白較穩定地結合。對接能量最低為SCN5A與賴氨酸;KCNH2與γ-氨基丁酸（Gamma-Aminobutyric Acid，GABA）;說明炙甘草湯活性物質可能與以上3種蛋白結合，在治療心律失常上發揮主要作用。

通過GO富集分析預測炙甘草湯對心律失常作用機制可能是與心臟收縮、心臟肌肉收縮、心的過程、橫紋肌收縮、心臟收縮調節、陽離子復雜通道、收縮纖維、肌節、收縮纖維部分、肌原纖維、電壓門控離子通道活性、電壓門控通道活動、離子通道綁定、頻道活動、被動跨膜轉運蛋白活性等有關。通過KEGG分析預測出炙甘草湯治療心律失?？赡芘c心肌細胞的腎上腺素能信號、肥厚型心肌病、cGMP-PKG信號通路、擴張型心肌病等有關。本研究說明炙甘草湯是通過多靶點、多通路來治療心律失常，通過研究其靶點及信號通路，今后可為開展動物或人體實驗進行驗證提供理論依據。

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（2020-10-27收稿 本文編輯：張雄杰）

基金項目：國家自然科學基金項目（81774208）;湖南省教育廳創新平臺開放基金重點項目（2017K070）

作者簡介：葉嘉豪（1996.08—），男，碩士研究生在讀，研究方向：心血管疾病證本質與診治規律，E-mail：1062940906@qq.com

通信作者：胡志希（1962.12—），男，博士，教授，博士研究生導師，研究方向：心血管疾病證本質與診治規律，E-mail：515800272@qq.com