薯蕷皂苷元對心肌缺血再灌注損傷大鼠細胞凋亡的影響及相關機制的分析

蔣先訓，張凱，張鷹

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）指在一段時間的缺血后，血液供應盡管恢復到心臟組織，但同時對心肌造成額外損害的組織損傷[1-2]。炎癥是心肌再灌注引起的微血管損傷和功能障礙的關鍵特征[3]。NOD樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體為由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1（Caspase-1）組裝的一種分子復合物[4-5]，在心肌缺血損傷過程中，NLRP3 炎性小體被激活，加劇炎癥反應。已有報道藥物可通過抑制NLRP3 炎性小體介導的細胞凋亡和炎癥反應減輕MIRI[6]。薯蕷皂苷元是一種植物源性皂苷元，可從野生山藥、葫蘆巴、大豆等多種植物中分離得到，具有降血糖、降血脂、抗炎和抗氧化等作用[7]。Ebrahimi 等[8]研究發現，薯蕷皂苷元可通過線粒體腺嘌呤核苷三磷酸敏感性鉀離子通道，減輕心肌再灌注損傷引起的炎癥反應，表明薯蕷皂苷元對MIRI 有治療作用。但薯蕷皂苷元是否還能通過其他機制發揮對MIRI 的治療作用目前尚不清楚。因此，本研究通過構建MIRI 大鼠模型，探究薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠的藥效作用，并初步分析其對NLRP3/caspase-1 通路的影響，進一步完善薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠，6 周齡，200～220 g，購自南華大學，許可證號：SCXK(湘) 2020-0003，常規飼養1 周后進行實驗。本研究動物實驗方案經南華大學衡陽醫學院附屬第二醫院倫理委員會批準，并按照動物護理和使用的指導方針進行的。

1.2 主要試劑

薯蕷皂苷元標準品（純度≥98%，SD8360）和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色液（G3005）購自北京索萊寶生物科技有限公司。蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（C0105）和TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（C1082）購自上海碧云天生物有限公司。白細胞介素-6（IL-6），白細胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。NLRP3 一抗、Caspase-1 一抗、ASC 一抗、IL-1β 一抗及二抗購自賽信通（上海）生物試劑有限公司。

1.3 實驗儀器

包括生物信息收集系統（BL-410，日本Nihon Kohden 公司）；小動物呼吸機（DH-140，浙江大學醫療器械廠）；顯微鏡（E400，日本Nikon 公司）；石蠟切片機（HHL210，德國Leica 公司）；電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠）；蛋白凝膠成像儀（AlphaImager HP，美國 Alpha Inotech 公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1動物模型制備

根據參考文獻[9]的方法，采用左前降支結扎模型建立MIRI 大鼠模型。將大鼠麻醉，以仰臥固定在手術臺上，并連接標準的導聯心電圖。切開頸部中間并連接動物呼吸機以進行通氣（呼吸頻率60 次/min，潮氣量8.0 ml，頻率5：4）。氣管內插管后，將左頸總動脈分離并置入導管中，并通過壓力傳感器連接到生物信息收集系統。進行左胸廓切開術和心包切開術以暴露心臟。將左前降支臨時結扎30 min，以達到局部缺血。通過心電圖ST 段抬高或移位和心臟缺血區（前心室壁和心尖部）顏色的改變，證實左前降支結扎成功。然后再灌注120 min，誘發心肌缺血再灌注損傷。假手術組僅穿線不結扎。

1.4.2動物分組及給藥

將造模成功的72 只SD 大鼠，按照隨機數字表法分成MIRI 組、薯蕷皂苷元低、中、高劑量組（分別給予50 mg/kg、75 mg/kg、100 mg/kg 的薯蕷皂苷元），每組18 只。再另取18 只大鼠做假手術組處理。分別于造模后給予薯蕷皂苷元低、中、高劑量組灌胃[10]，生理鹽水制備不同濃度的薯蕷皂苷元，灌胃體積為10 ml/kg，每日1 次，連續4 周。假手術組和MIRI 組給予等體積生理鹽水灌胃。

1.4.3心臟功能測定

記錄每組大鼠在不同時間段的心臟血液動力學參數。大鼠右側頸總動脈插管至左心室，并連接壓力傳感器通過BL-410 生物信息收集系統，記錄并分析左心室收縮壓（LVSP），左心室舒張末期壓力（LVEDP），左心室射血分數（LVEF），短軸縮短率（FS）及最大收縮/舒張期壓力變化速率（±dp/dtmax）。

1.4.4心肌梗死面積的測量

從每組大鼠隨機選擇6 只，再次結扎左前降支，左側頸總動脈注入1%伊文思藍1 ml。取出心臟，用預冷生理鹽水反復沖洗，在-70℃快速冷凍，切成約1～2 mm 厚的薄片，置于1% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液中，37℃水浴孵育15～30 min，10%甲醛固定10 min。拍攝照片，使用Image Pro Plus 軟件計算左心室梗死面積百分比。

1.4.5心肌組織病理學檢測

每組隨機選取6 只大鼠，將心臟組織置于10%福爾馬林中固定24 h，分級脫水，切成5 μm 厚度的切片，使用HE 染色試劑盒對切片進行染色，并于光學顯微鏡下分析心肌組織的形態學變化。

1.4.6檢測心肌細胞凋亡指數

利用TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒對心肌細胞的凋亡情況進行檢測。操作步驟為：取1.4.5 制備的石蠟切片，脫蠟，蛋白酶消化20 min 后清洗，加入TUNEL 反應混合液，于37℃下封閉30 min，加底物顯色，HE 復染，脫水，封片。觀察并計算：凋亡細胞率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.4.7檢測血清炎性因子含量

將收集的血清根據ELISA 試劑盒說明書操作，檢測各組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 的含量。

1.4.8大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表達水平測定

將每組剩余的6 只大鼠的心臟取出，液氮速凍研磨，加入裂解液制成勻漿，提取總蛋白，使用二辛可寧酸（BCA）試劑盒定量后，經SDS-PAGE 電泳后轉膜，封閉加一抗（NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、β-肌動蛋白，稀釋倍數1：500），4℃過夜孵育后清洗，加二抗，在室溫下孵育2 h，清洗曝光顯色，分析條帶的灰度值。

1.5 統計學方法

采用SPSS 25 軟件進行數據分析。所有數據均用均數±標準差表示。數據首先用單因素方差分析進行分析，然后進行后處理的Bonferroni 檢驗。P＜0.05 被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心功能的影響（表1）

表1 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心功能的影響（,n=18）

表1 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心功能的影響（,n=18）

注：MIRI：心肌缺血再灌注損傷；LVSP：左心室收縮壓；LVEDP：左心室舒張末期壓力；LVEF：左心室射血分數；FS：短軸縮短率；+dp/dtmax：最大收縮期壓力變化速率；-dp/dtmax：最大舒張期壓力變化速率。與假手術組比*P＜0.05；與MIRI 組比△P＜0.05；與薯蕷皂苷元低劑量組比▲P＜0.05；與薯蕷皂苷元中劑量組比#P＜0.05。1 mmHg=0.133 Kpa

與假手術組相比，MIRI 組大鼠LVEDP 顯著升高（P＜0.05），LVSP、LVEF、FS 及±dp/dtmax顯著降低（P均＜0.05）；與MIRI 組相比，薯蕷皂苷元低、中、高各劑量組大鼠LVEDP 均顯著降低（P均＜0.05），LVSP、LVEF、FS 及±dp/dtmax均顯著升高（P均＜0.05）。

2.2 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌梗死面積的影響（表2）

表2 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌梗死面積的影響（,n=6）

表2 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌梗死面積的影響（,n=6）

注：MIRI：心肌缺血再灌注損傷。與假手術組比*P＜0.05；與MIRI 組比△P＜0.05；與薯蕷皂苷元低劑量組比▲P＜0.05；與薯蕷皂苷元中劑量組比#P＜0.05

MIRI 組大鼠心肌梗死面積明顯高于假手術組（P＜0.05）,而經過不同劑量薯蕷皂苷元干預的大鼠心肌梗死面積均顯著降低（P＜0.05）。

2.3 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌組織病理變化的影響

MIRI 組大鼠心肌組織局部變性壞死，肌纖維紊亂、斷裂溶解，間質充血水腫，并伴有炎細胞浸潤；薯蕷皂苷元各劑量組隨劑量增加而心肌損傷依次減輕，其中薯蕷皂苷元高劑量組大鼠心肌組織中肌纖維排列整齊，部分肌束間隙增寬，間質輕度腫脹，僅少量炎性細胞浸潤，見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態學變化（×400）

2.4 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌細胞凋亡指數的影響（表3）

表3 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌細胞凋亡指數的影響（,n=6）

表3 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌細胞凋亡指數的影響（,n=6）

注：MIRI：心肌缺血再灌注損傷。與假手術組比*P＜0.05；與MIRI 組比△P＜0.05；與薯蕷皂苷元低劑量組比▲P＜0.05；與薯蕷皂苷元中劑量組比#P＜0.05

與假手術組相比，MIRI 組大鼠心肌細胞凋亡指數顯著升高。與MIRI 組相比，薯蕷皂苷元低、中、高劑量干預組大鼠心肌細胞凋亡指數均顯著降低[（49.49±6.27）% vs.（37.56±4.98）%，（49.49±6.27）% vs.（28.35±3.64）%，（49.49±6.27）%vs.（16.93±2.25）%，P均＜0.05]。

2.5 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠血清中炎性因子水平的影響（表4）

表4 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠血清中炎性因子水平的影響（pg/ml，±s，n=12）

MIRI 組大鼠血清中炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α 水平明顯高于假手術組（P均＜0.05），而經薯蕷皂苷元低、中、高劑量干預后，IL-6、IL-1β、TNF-α 水平顯著降低（P均＜0.05）。

2.6 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表達水平的影響（圖2、表5）

表5 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表達水平的影響（,n=6）

表5 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表達水平的影響（,n=6）

注：MIRI：心肌缺血再灌注損傷；NLRP3：NOD 樣受體蛋白3；Caspase-1：半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1；ASC：凋亡相關斑點樣蛋白；IL-1β：白細胞介素-1β；β-actin：β-肌動蛋白。與假手術組比*P＜0.05；與MIRI 組比△P＜0.05；與薯蕷皂苷元低劑量組比▲P＜0.05；與薯蕷皂苷元中劑量組比#P＜0.05

圖2 各組大鼠心肌組織蛋白免疫印跡條帶圖

與假手術組相比，MIRI 組大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β蛋白表達水平顯著升高（P均＜0.05）；與MIRI 組相比，薯蕷皂苷元各劑量組大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表達水平顯著降低（P均＜0.05）。

3 討論

MIRI 在世界范圍內有嚴重的發病率和死亡率，發病機制涉及多種機制的相互作用，包括鈣超載、氧化應激損傷、心肌細胞自噬和細胞凋亡等[11-12]。眾所周知，對缺血后炎癥的先天免疫反應在MIRI 的病理生理中起著重要作用[13]，但與心臟損傷相關的機制仍有待于進一步研究。LVEDP 和LVSP 是左心室舒張收縮功能的重要指標，±dp/dtmax反映左心室收縮和舒張期運動速度，受左心室心肌細胞效率的影響[14]。本研究通過建立MIRI 大鼠模型，經HE 染色后觀察可發現，MIRI 大鼠心肌組織局部變性壞死，間質充血水腫，并伴有炎細胞浸潤。TTC 法檢測到心肌梗死面積增加，TUNEL 法檢測到心肌細胞凋亡指數增加，ELISA 結果顯示血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平升高。BL-410 生物信息收集系統觀察到LVEDP 升高，而LVSP、LVEF、FS 及再灌流期間的±dp/dtmax降低，表明模型建立成功。

薯蕷皂苷元是由藤井和松川于1935 年在山萆薢中首次發現的，是一種天然的甾體皂甙元[15]。薯蕷皂苷元在傳統醫學中已被用作膳食補充劑，用于治療高血糖、高脂血癥、炎癥和胃腸道疾病等問題[16]。薯蕷皂苷元可通過上調CX-43 的表達和激活來減輕心肌缺血/再灌注誘發的室性心律失常[17]。本研究結果發現，與MIRI 組相比，薯蕷皂苷元各劑量組大鼠經HE 染色后觀察到心肌損傷明顯減輕，僅少量炎性細胞浸潤，ELISA 結果也顯示IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎性因子水平降低，BL-410 生物信息收集系統檢測的各項心功能指標也明顯逆轉，表明薯蕷皂苷元可顯著改善MIRI 大鼠的損傷情況，減少炎癥反應及細胞凋亡，改善左心室的泵血效率。

NLRP3 炎性小體激活在MIRI 中起重要作用，當其被激活時，NLRP3 與ASC 形成炎性復合物，從而控制Caspase-1 的激活，并隨后促進促炎性細胞因子（如IL-1β 和IL-18）的分泌，最終導致細胞損傷和死亡[18]。NLRP3 炎性小體可促進心臟微血管內皮細胞的心肌缺血再灌注損傷，miR-377-5p 可靶向抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β 信號通路，從而減輕心肌缺血再灌注損傷和缺氧/復氧心肌細胞凋亡[19]。在腦缺血/再灌注損傷大鼠中，D-香芹酮可抑制TLR4/NLRP3 信號通路，減輕腦損傷[20]。在微血管再灌注損傷大鼠中，天麻素亦可通過調節NLRP3/Caspase-1 途徑，改善再灌注引起的細胞凋亡[21]。在本研究中，Western blot 結果發現心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表達水平在MIRI 大鼠中明顯升高，而在薯蕷皂苷元作用下，心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表達水平明顯降低，表明薯蕷皂苷元可能通過抑制NLRP3/Caspase-1 通路，減輕MIRI 大鼠的炎癥反應。

綜上所述，薯蕷皂苷元的應用可改善MIRI 大鼠的左心功能，減少心肌梗死和細胞凋亡，保護心肌免受缺血再灌注損傷，該作用可能與抑制NLRP3/Caspase-1 信號通路有關。然而，本研究結果僅說明減輕MIRI 大鼠的心肌損傷與抑制NLRP3/Caspase-1通路有關，不能說通過抑制NLRP3/Caspase-1 通路而減輕MIRI 大鼠損傷，后續將對此方面補充細胞實驗，采用NLRP3 活化的選擇性抑制劑等對缺氧復氧心肌細胞進行相關研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突