天然東北紅豆杉林土壤細菌多樣性研究

賈丹 王琪瑤 肖宇飛 劉玉龍 梁素鈺

摘 要：利用高通量測序方法研究不同林齡的東北紅豆杉林根際及非根際土壤細菌多樣性，同時測定土壤養分（總有機質、全氮、全磷及全鉀）含量。通過對土壤細菌多樣性及其與土壤養分之間關系的研究，得到紅豆杉林根際與非根際土壤微生物的結構和土壤養分因子對土壤微生物多樣性的影響等信息，從而對天然東北紅豆杉的保護提供理論支持。結果表明，東北紅豆杉不同林齡之間、根際與非根際之間土壤肥力均差異顯著（P<0.05）;實驗地區土壤細菌共分為44個菌門，優勢菌門為變形菌門（相對豐度為40.54%～43.89%）和酸桿菌門（相對豐度為16.53%～28.81%）;土壤全磷與細菌的相關性較高;所有樣地共同解釋30.46%的細菌變異率;成熟林樣地內的主要細菌菌門為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、棒狀桿菌門和硝化螺旋菌門。土壤總有機質、全磷、全氮和全鉀含量在成熟林樣地內占主導地位，所以，天然東北紅豆杉根際土壤細菌多樣性豐度低于非根際土壤;病腐木根際土壤細菌對土壤細菌變異的貢獻率最大;引起微生物變異的最主要因素為土壤全磷。

關鍵詞：東北紅豆杉;高通量測序;土壤養分;土壤微生物;細菌多樣性

中圖分類號：S714.5??? 文獻標識碼：A?? 文章編號：1006-8023（2022）03-0026-06

Study on Soil Bacterial Diversity of Natural Taxus cuspidata? Forest

JIA Dan， WANG Qiyao， XIAO Yufei， LIU Yulong， LIANG Suyu

（Heilongjiang Institute of Ecology， Harbin 150081， China）

Abstract：In this study， high throughput sequencing was used to study the bacterial diversity in rhizosphere soil and non rhizosphere soil of Taxus cuspidata forest at different ages， and the contents of soil nutrients （total organic matter， total nitrogen， total phosphorus and total potassium） were determined. Through the study of soil bacterial diversity and the relationship between soil bacterial diversity and soil nutrients， the structure of rhizosphere soil and non rhizosphere soil microorganisms in Taxus cuspidata forest and the impact of soil nutrient factors on soil microbial diversity were obtained， so as to provide theoretical support for the protection of natural Taxus cuspidata. The results showed that there were significant differences in soil fertility in different forest ages and in rhizosphere soil and non rhizosphere soil of Taxus cuspidata forest （P<0.05）. There were 44 phyla in the experimental area， and the dominant phyla were Proteobacteria （relative abundance： 40.54%-43.89%） and Acidobacteria （relative abundance：16.53%-28.81%）. There was high correlation between soil total phosphorus and bacteria. The soil total phosphorus could explain 30.46% of bacterial variation rate in all plots. The main bacterial phyla in the mature forest sample plot were Proteobacteria， Firmicutes， Bacteroidetes， Gemmatimonadetes， Chloroflexi， Rokubacteria and Nitrospirae. The contents of total organic matter， total phosphorus， total nitrogen and total potassium were dominant in mature forest plots. The bacterial diversity in rhizosphere soil of Taxus cuspidata was lower than that in non rhizosphere soil. The contribution rate of rhizosphere soil bacteria to soil bacterial variation was the largest. The main factor causing microbial variation was soil total phosphorus.532E945A-892D-40FE-9AAE-7ACC3F1AA1F0

Keywords：Taxus cuspidata; high throughput sequencing; soil nutrient; soil microorganism; bacterial diversity

0 引言

土壤細菌是土壤的重要組成部分，可以分解土壤中的有機質，從而促進土壤的養分循環[1]，對植物生長產生比較大的影響 [2-6]。森林的演替是植物和土壤細菌多樣性變化的主要原因之一[7]，有研究表明，植物根際細菌與植物的生長發育等方面有著緊密聯系[8]，而土壤化學性質是驅動土壤細菌變異的最主要因子[9]。土壤微生物多樣性的穩定有利于森林生態系統維持多樣性和穩定性[10-11]。近年來，高通量測序技術憑借著快速、高效和覆蓋性高等優點逐步成為研究微生物多樣性的手段[12]，通過該技術的使用，使得森林土壤微生物多樣性的研究取得了較大的進步[13-14]。

東北紅豆杉（Taxus cuspidata）是我國一級保護植物，有著較高的科研價值。但是，隨著全球氣候變化、人為干擾[15]和土壤環境改變[16-17]等因素的影響，天然東北紅豆杉林的面積正在進一步縮小。本項研究分別提取3種類型（成熟林、中齡林及枯立木）東北紅豆杉根際土壤與非根際土壤總DNA，通過高通量測序的方法得到東北紅豆杉土壤細菌的多樣性信息。同時測定土壤總有機質、全氮、全磷和全鉀的含量，結合高通量測序結果分析土壤細菌多樣性與土壤肥力的關系，以期對保護天然東北紅豆杉方面提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

樣地位于黑龍江省牡丹江市穆棱紅豆杉自然保護區（130°18′E，43°53′N）內，該地區多為丘陵地帶，土壤以暗棕壤為主，年平均氣溫3.1 ℃，年平均降水量510～560 mm。研究共設置3塊樣地，分別為紅豆杉成熟林（A）、紅豆杉中齡林（B）及病腐木對照林（C）。3塊樣地的面積均為400 m2，樣地坡向均為北坡，平均坡度為5°，郁閉度為0.6～0.8。伴生樹種為蒙古櫟（Quercus mongolica Fisch. ex Ledeb）、臭冷杉（Abies nephrolepis （Trautv.） Maxim）、楓樺（Betula costata Trautv）和椴樹（Tilia tuan Szyszyl）等，灌木以簇毛槭（Acer barbinerve Maxim）、長白忍冬（Lonicera ruprechtiana Regel）、溲疏（Deutzia scabra Thunb）、茶藨子（Ribes janczewskii Pojark）和鼠李（Rhamnus davurica Pall）為主。

1.2 土壤樣本的采集

土壤樣本分為根際土壤和非根際土壤。根際土壤樣本的取樣方法為：選取樣地內所有紅豆杉作為對象，利用花匠鏟挖出根部，再收集根部土壤，每株紅豆杉取5個平行樣進行混合，每個樣地共取3株紅豆杉根際土作為一組。非根際土壤樣本則是在樣地內按“Z”字形進行取樣，共取7個點混合后為一個平行樣，每個樣地共取3個平行樣，土壤樣本編號見表1。

將每個土壤樣本平均分為2份，一份裝入無菌自封袋中，風干后保存;另一份裝入無菌離心管中，置于干冰中低溫保存，盡快帶回實驗室放入-80 ℃冰箱中保存。

1.3 實驗方法

將風干的土壤過2 mm篩后，測定土壤養分。土壤總有機質（SOM）利用碳氮分析儀（德國耶拿分析儀器股份公司，型號為Multi N/C 2100）進行測定;土壤全氮（TN）利用凱氏定氮儀（山東海能科學儀器有限公司， 型號為K9860）進行測定;土壤全鉀（TK）利用原子吸收光譜（賽默飛世爾科技有限公司，型號為ICE3300）進行測定;土壤全磷（TP）利用比色法進行測定[18]。

稱取5 g低溫保存的土壤，利用土壤DNA提取試劑盒（美國MO BIO公司，型號為PowerSoilDNA Isolation Kit）提取土壤總DNA，再利用引物27F與1 492 R擴增細菌的V3+V4區，得到原始數據（Raw Data），再將原始數據進行拼接、過濾和質控等步驟得到樣本的操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）信息。利用OTU信息來注釋物種和后續的多樣性分析[19]。

1.4 數據的統計與分析

文中的方差分析、相關性分析、主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）等利用IBM SPSS軟件進行統計分析，Alpha多樣性指數和冗余分析利用R語言軟件中的Vegan擴展包進行分析，UniFrac距離利用FastTree軟件進行運算[18]。

2 結果與分析

2.1 土壤養分含量的測定

測定風干土壤的總有機質、全氮、全磷和全鉀的含量，結果見表2。

由表2可知，6個樣本中的土壤化學性質之間的差異較大，其中土壤總有機質含量大小為：A1>C1>C2>B1>A2>B2;全氮含量的大小為：A1>C1>A2>B1>C2>B2;全磷含量大小為：A1>A2>C1>C2>B2>B1;全鉀含量大小為：A2>B2>B1>C2>A1>C1。從測試結果來看，成熟林根際土壤的總有機質、全氮和全磷的含量最高，而全鉀含量較低。中齡林的非根際土的總有機質和全氮的含量最低。

2.2 土壤細菌OTU分析

將測序得到的OTU結果進行對比后，得到了土壤細菌的物種信息，本研究共得到44個細菌菌門，其中相對豐度前10位的菌門占總體的96%以上，為優勢菌門，結果見表3。

由表3可知，樣地內豐度前10位的細菌菌門為：變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、棒狀桿菌門（Rokubacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）。所有樣地中，變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和芽單胞菌門4個菌門差異不顯著，其余菌門差異顯著（P<0.05）。豐度第二的酸桿菌門在紅豆杉成熟林中的數量明顯低于其他兩塊樣地。成熟林根際土壤的擬桿菌門數量遠高于其他樣地。B2、C1和C2土壤樣本中的疣微菌門數量高于A1、A2和B1。A2中綠彎菌門數量最多，C1中最少。棒狀桿菌門在A1中數量最多，B1中數量最少。硝化螺旋菌門在A2中最多，B1中數量最少。532E945A-892D-40FE-9AAE-7ACC3F1AA1F0

2.3 土壤養分與細菌門相關性分析

為了研究土壤養分與土壤細菌的相關性，將土壤養分含量與相對豐度前10位的菌門進行相關性分析，具體結果見表4。

由表4可知，土壤全磷與擬桿菌門呈極顯著正相關，與綠彎菌門、棒狀桿菌門和硝化螺旋菌門呈顯著正相關。土壤全氮含量與擬桿菌門呈極顯著正相關。

2.4 土壤細菌Alpha多樣性指數分析

Alpha多樣性指數分析又稱組內分析，是分析每個樣本內土壤細菌多樣性的一種方法。本研究共選擇物種檢出數量（observed species）、Shannon多樣性指數、Chao1多樣性指數、ACE多樣性指數和覆蓋度（goods coverage）5個指標進行分析，結果見表5。

由表5可知，檢出物種數量由高到低順序為：B2>C2>A2>A1>C1>B1。Shannon指數順序為：B2>A2>C2>A1>C1>B1。Chao1指數為：B2>C2>A1>C1>A2>B1。ACE指數為：B2>C2>A1>C1>A2>B1。其中B2樣本中無論是檢出物種的數量還是多樣性指數均為最高，B1則為最低。在A組和C組也得到相同的結論，即根際土壤細菌多樣性均低于非根際土壤細菌多樣性。

2.5 土壤細菌Beta組間分析

Beta組間分析，目的是分析各樣本之間細菌多樣性的差異。本研究選用PCA對6個樣本細菌多樣性進行分析，結果如圖1所示。

由圖1可知，第一主成分B1、C1和B2與其余樣地區分開來（在第一主成分上的貢獻值為正），B1在第一主成分上的貢獻率最大。B2、C2和C1在第二成分上的貢獻率為正，且B2的貢獻率最大。所有樣地共同解釋細菌變異率的30.46%，6個樣本中C1對細菌變異率的貢獻最大。

由圖2可知，6個樣本中的土壤細菌在門水平上分為兩大類，即A1與A2在遺傳距離為0.118 0處聚成一類，其余4個樣本聚成一類，兩大類的遺傳距離為0.089 0。其中，B2與C1遺傳距離最小為0.048 9，C2與C1、B2的遺傳距離為0.001 0。B2、C1、C2與B1的遺傳距離為0.045 1。

2.6 土壤養分與土壤細菌冗余分析

為了研究土壤細菌受土壤養分的影響，將豐度前10的土壤細菌門與土壤養分進行冗余分析（redundancy analysis， RDA），結果如圖3所示。

由圖3可知，變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、棒狀桿菌門和硝化螺旋菌門與A1和A2的相關性較高，而酸桿菌門、放線菌門和疣微菌門與其余樣本的相關性更高。

土壤總有機質、土壤全氮、土壤全磷和土壤全鉀均在A樣地內起主導作用，且引起微生物變異的最主要因素為土壤全磷，土壤總有機質的影響最小。

3 討論

本研究表明，天然紅豆杉林地內土壤細菌豐度最高的2個門為變形菌門和酸桿菌門，這與以往的相關研究報道一致[18， 20]，這主要是因為變形菌門和酸桿菌門的生態位較高，且這2個菌門的細菌都有較高的環境適應性[21-22]。由PCA和聚類分析結果可知，A樣地與其他兩塊樣地的土壤微生物親緣關系較遠，結合Alpha分析可以得到成熟林樣地內土壤細菌構成與中齡林差距較大，這與李萍等[23]的研究結果一致。

范媛媛等[24]研究表明，針葉樹種成熟林地內土壤養分高于中齡林，這與本研究的結果一致，這是因為土壤養分會隨著枯落物的增加而增加，而成熟林的枯落物要高于中齡林[25-26]。曹升等[27]研究表明，不同林齡的土壤微生物的差別較大，成熟林土壤細菌是土壤微生物變異的最主要因素，這與本研究的結果一致。

RDA結果表明，全磷是驅動細菌變異的最主要因素，主要由于本研究土壤優勢菌門為變形菌門，而變形菌門是分解有機質的主要細菌[20]，土壤全磷與細菌優勢菌門的相關性較高 [28]。這與姜雪薇等[28] 的研究結果一致。

4 結論

本文利用高通量測序方法研究了天然東北紅豆杉林地土壤微生物的多樣性，同時測定了土壤養分含量，將所得到的結果進行分析得到了如下結論。

（1）根據Alpha多樣性分析的結果表明，天然東北紅豆杉根際土壤細菌多樣性豐度低于非根際土壤。

（2）PCA分析的結果表明，病腐木根際土壤細菌對土壤細菌變異的貢獻率最大。

（3）由RDA的結果可以得到土壤全磷含量是引起土壤細菌變異的主要因素，且相關性分析結果也證明土壤全磷含量與某些細菌的相關性較高。

【參 考 文 獻】

[1]NAKAYAMA M， IMAMURA S， TANIGUCHI T， et al. Does conversion from natural forest to plantation affect fungal and bacterial biodiversity， community structure， and co-occurrence networks in the organic horizon and mineral soil？ [J]. Forest Ecology and Management， 2019， 446： 238-250.

[2]SHEN R C， XU M， LI R Q， et al. Spatial variability of soil microbial biomass and its relationships with edaphic， vegetational and climatic factors in the Three-River Headwaters region on Qinghai-Tibetan Plateau[J]. Applied Soil Ecology， 2015， 95： 191-203.532E945A-892D-40FE-9AAE-7ACC3F1AA1F0

[3]ZHANG T， LI Y F， CHANG S X， et al. Converting paddy fields to Lei bamboo （Phyllostachys praecox） stands affected soil nutrient concentrations， labile organic carbon pools， and organic carbon chemical compositions[J]. Plant and Soil， 2013， 367（1/2）： 249-261.

[4]ANDERSSON K O， TIGHE M K， GUPPY C N， et al. Incremental acidification reveals phosphorus release dynamics in alkaline vertic soils[J]. Geoderma， 2015， 259/260： 35-44.

[5]MARTIN M， STANCHI S， JAKEER HOSSAIN K M， et al. Potential phosphorus and arsenic mobilization from Bangladesh soils by particle dispersion[J]. Science of the Total Environment， 2015， 536： 973-980.

[6]TIAN K， ZHAO Y C， XU X H， et al. Effects of long-term fertilization and residue management on soil organic carbon changes in paddy soils of China： a meta-analysis[J]. Agriculture， Ecosystems & Environment， 2015， 204： 40-50.

[7]賈丹， 王剛， 王文帆， 等. 利用RAPD技術對牡丹江地區紅松根際土壤微生物多樣性的分析[J]. 森林工程， 2013， 29（6）： 33-35， 61.

JIA D， WANG G， WANG W F， et al. Analysis of Korean pine rhizosphere soil microorganism diversity in Mudanjiang area by using RAPD technique[J]. Forest Engineering， 2013， 29（6）： 33-35， 61.

[8]BERENDSEN R L， PIETERSE C M J， BAKKER P A H M. The rhizosphere microbiome and plant health[J]. Trends in Plant Science， 2012， 17（8）： 478-486.

[9]馬轉轉， 喬沙沙， 曹苗文， 等. 環境選擇和擴散限制驅動溫帶森林土壤細菌群落的構建[J]. 應用生態學報， 2018， 29（4）： 1179-1189.

MA Z Z， QIAO S S， CAO M W， et al. Environmental selection and dispersal limitation drive the assemblage of bacterial community in temperate forest soils[J]. Chinese Journal of Applied Ecology， 2018， 29（4）： 1179-1189.

[10]李明美， 全飛， 孫樹晴， 等. 近自然管理對橡膠林土壤細菌組成及多樣性的影響[J]. 西部林業科學， 2021， 50（5）： 81-89.

LI M M， QUAN F， SUN S Q， et al. The effect of close-to-natural management on soil bacteria in rubber plantations[J]. Journal of West China Forestry Science， 2021， 50（5）： 81-89.

[11]DENG H， GUO G X， ZHU Y G. Pyrene effects on methanotroph community and methane oxidation rate， tested by dose-response experiment and resistance and resilience experiment[J]. Journal of Soils and Sediments， 2011， 11（2）： 312-321.

[12]QUAIL M A， KOZAREWA I， SMITH F， et al. A large genome centers improvements to the Illumina sequencing system[J]. Nature Methods， 2008， 5 （12）： 1005-1010.

[13]LEPLEUX C， UROZ S， COLLIGNON C， et al. A short-term mineral amendment impacts the mineral weathering bacterial communities in an acidic forest soil[J]. Research in Microbiology， 2013， 164（7）： 729-739.532E945A-892D-40FE-9AAE-7ACC3F1AA1F0

[14]HARTMANN M， HOWES C G， VANINSBERGHE D， et al. Significant and persistent impact of timber harvesting on soil microbial communities in Northern coniferous forests[J]. The ISME Journal， 2012， 6 （12）： 2199-2218.

[15]ZU Y G， CHEN H F， WANG W J， et al. Population structure and distribution pattern of Taxus cuspidata in Muling region of Heilongjiang Province， China[J]. Journal of Forestry Research， 2006， 17（1）： 80-82.

[16]陳杰，龍婷，楊藍，等.東北紅豆杉生境適宜性評價[J].北京林業大學學報，2019，41（4）：51-59.

CHEN J， LONG T， YANG L， et al. Habitat suitability assessment of Taxus cuspidate[J]. Journal of Beijing Forestry University， 2019， 41（4）： 51-59.

[17]姜泉.紅豆杉種子育苗技術研究[J].林業科技情報，2021，53（4）：78-80.

JIANG Q. Study on seed seedling raising technology of Taxus Linn.[J]. Forestry Science and Technology Information， 2021， 53（4）： 78-80.

[18]JIA D， DONG X B， LI Y H. Effect of strip harvesting on bacterial diversity of forest soils in the Daxingan Mountains[J]. Soil Science Society of America Journal， 2020， 84（2）： 512-521.

[19]ADAMS R I， MILETTO M， TAYLOR J W， et al. Dispersal in microbes： fungi in indoor air are dominated by outdoor air and show dispersal limitation at short distances[J]. The ISME Journal， 2013， 7 （7）： 1262-1273.

[20]喬沙沙，周永娜，劉晉仙，等.關帝山針葉林土壤細菌群落結構特征[J].林業科學，2017，53（2）：89-99.

QIAO S S， ZHOU Y N， LIU J X， et al. Characteristics of soil bacterial community structure in coniferous forests of guandi mountains， Shanxi Province[J]. Scientia Silvae Sinicae， 2017， 53（2）： 89-99.

[21]范雅倩，安菁，梁晨.北京市松山國家級自然保護區典型植被群落的土壤微生物群落結構特征[J].北方園藝，2021（1）：81-86.

FAN Y Q， AN J， LIANG C. Soil microbial structure characteristics of typical vegetation communities in Beijing City Songshan national nature reserve[J]. Northern Horticulture， 2021（1）： 81-86.

[22]唐靚茹，劉雄盛，蔣燚，等.紅錐 4 種林型土壤理化性質及微生物量差異分析 [J].中南林業科技大學學報，2020， 40（1）：76-81， 104.

TANG J R， LIU X S， JIANG Y， et al. Analysis on difference of soil physical and chemical properties and microorganism quantity in four types Castanopsis hystrix forest[J]. Journal of Central South University of Forestry & Technology， 2020， 40（1）：76-81， 104.

[23]李萍，史榮久，趙峰，等.大興安嶺落葉松林不同演替階段土壤細菌群落結構與功能潛勢[J].應用生態學報，2019，30（1）：95-107.

LI P， SHI R J， ZHAO F， et al. Soil bacterial community structure and predicted functions in the larch forest during succession at the Greater Khingan Mountains of Northeast China[J]. Chinese Journal of Applied Ecology， 2019， 30（1）： 95-107.532E945A-892D-40FE-9AAE-7ACC3F1AA1F0

[24]范媛媛，李懿，李啟迪.不同林齡油松土壤微生物、酶活性和養分特征[J].水土保持研究，2019，26（6）：58-64.

FAN Y Y， LI Y， LI Q D. Microbe， enzymatic activity and nutrient contents of soils in different stand ages of Pinus tabuliformis[J]. Research of Soil and Water Conservation， 2019， 26（6）： 58-64.

[25]DALY K R， MOONEY S J， BENNETT M J， et al. Assessing the influence of the rhizosphere on soil hydraulic properties using X-ray computed tomography and numerical modelling[J]. Journal of Experimental Botany， 2015， 66（8）： 2305-2314.

[26]LI H， YANG X R， WENG B S， et al. The phenological stage of rice growth determines anaerobic ammonium oxidation activity in rhizosphere soil[J]. Soil Biology and Biochemistry， 2016， 100： 59-65.

[27]曹升，潘菲，林根根，等.不同林齡杉木林土壤細菌群落結構與土壤酶活性變化研究[J].生態學報，2021，41（5）：1846-1856.

CAO S， PAN F， LIN G G， et al. Changes of soil bacterial structure and soil enzyme activity in Chinese fir forest of different ages[J]. Acta Ecologica Sinica， 2021， 41（5）： 1846-1856.

[28]姜雪薇，馬大龍，臧淑英，等.高通量測序分析大興安嶺典型森林土壤細菌和真菌群落特征[J].微生物學通報，2021，48（4）：1093-1105.

JIANG X W， MA D L， ZANG S Y， et al. Characteristics of soil bacterial and fungal community of typical forest in the Greater Khingan Mountains based on high-throughput sequencing[J]. Microbiology China， 2021， 48（4）： 1093-1105.532E945A-892D-40FE-9AAE-7ACC3F1AA1F0