FSIP1促進乳腺癌細胞遷移和侵襲并導致患者不良預后

何偉丹 李志高

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，居女性惡性腫瘤死亡率的首位[1]。近年來乳腺癌的診治取得了極大進步，其死亡率也逐漸降低[2]。早期乳腺癌的治療主要采取外科手術和化療。但對于中晚期及復發轉移型乳腺癌，傳統化療常常誘發腫瘤耐藥，治療效果并不理想[3]。

目前以基因為切入點探究乳腺癌發生發展的分子機制已成為乳腺癌診療的新趨勢，對于提高晚期乳腺癌患者的生存率具有十分重要的意義[4-5]。有研究提出，基因檢測可作為制定早期乳腺癌治療方案的輔助手段[6]。人表皮生長因子受體-2(HER2)是迄今為止研究比較透徹的乳腺癌基因之一[7]。纖維鞘相互作用蛋白1(Fibrous sheath interacting protein 1，FSIP1)是一種癌/睪丸抗原基因，在乳腺癌細胞中高表達。FSIP1可以與HER2結合，增強乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力[8]。然而，FSIP1在乳腺癌中的生物學作用尚未完全闡明[9]。本研究主要探究FSIP1在乳腺癌發生發展中的生物學作用，從細胞學層面為乳腺癌的治療和研究提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 乳腺癌組織樣本和病例資料收集

本研究選取2004年1月—2018年12月于哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院確診的404例乳腺癌患者癌組織和癌旁正常乳腺組織，收集的組織樣本包括60例臨床Ⅰ/Ⅱ期(14.85%)、118例Ⅲ期(29.21%)和226例Ⅳ期(55.94%)乳腺癌。病例入選標準如下：(1)女性，通過手術切檢或穿刺活檢病理確診為乳腺癌，術后病理與穿刺病理結果不一致時以術后病理為準；(2)排除雙側乳腺癌、有其他腫瘤病史患者及拒絕參與者；(3)所有臨床樣本需經3名病理科醫生獨立診斷，癌旁組織需距癌組織切緣3 cm以上，鏡下切緣檢測確保切緣處無癌細胞或異型細胞。收集符合納入標準患者的病例資料。收集的臨床病例資料包括患者姓名、年齡、性別、婚育史、既往史、家族史、激素藥物應用史、腫瘤的生長部位、腫瘤數目及形態、區域淋巴結轉移情況、臨床病理分期、腫瘤病理診斷、病理類型及分級、各項免疫組化指標、手術方式等情況。采取電話隨訪結合門診復查病歷資料的方式對入選患者進行隨訪，隨訪日期為2004年1月—2018年12月?；颊咝g后第一天至其最終死亡時間或者到隨訪終止時間記為總生存時間(OS)。本研究經哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院倫理委員會審批同意，標本庫中存儲的所有標本于實驗展開前均已獲得患者本人簽署的知情同意書。

1.2 免疫組織化學

將石蠟包埋的乳腺癌及癌旁組織切片浸入二甲苯中以除去石蠟，然后用乙醇梯度重新水化。使用3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性，采用檸檬酸鈉法對組織切片進行抗原修復?？乖迯秃蟮氖炃衅匀焕鋮s至室溫。隨后用含有5%山羊血清的封閉液進行封閉，然后用抗FSIP1抗體(稀釋比例為1∶200)在濕盒中4℃孵育過夜。用PBS洗滌后，將切片與HRP偶聯的二抗(1∶500)在室溫下孵育1 h。隨后滴加DAB工作液進行復染，經梯度脫水后光學顯微鏡下觀察染色結果。對染色結果進行評分，評分過程由3名副高職以上的病理科醫生以盲評法完成。陽性染色細胞數<5%記為“陰性”。陽性染色細胞百分比評分：0分，陽性細胞數<5%；1分，陽性細胞數5%～25%；2分，陽性細胞數26%～50%；3分，陽性細胞數>50%。細胞染色強度評分：0分，陰性；1分，弱染色；2分，中染色；3分，強染色?？偡謹凳怯申栃员壤梅殖艘约毎旧珡姸鹊梅炙贸龅淖罱K得分(總分0～9分)?？偡帧?的組織切片為FSIP1高表達，總分<4的則歸為低表達[10]。

1.3 細胞培養和慢病毒轉導

乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、SK-BR-3、T-47D及正常乳腺上皮細胞(HMECs)MCF-10A于含有10% FBS，100 mg/mL鏈霉素和100 IU/mL青霉素的RPMI-1640培養基中培養，并置于37℃、5% CO2培養箱內。每隔24 h更換培養液。采用CRISPR/CAS9技術對FSIP1高表達乳腺癌細胞系MDA-MB-231和SK-BR-3中的FSIP1基因進行敲除，慢病毒的轉染參照說明書進行。GFP標記的CAS9-sgRNA作為陰性對照。

1.4 Western blot實驗

收集經細胞培養的乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、SK-BR-3、T-47D和HMECs(MCF-10A)及敲除FSIP1基因的MDA-MB-231和SK-BR-3細胞系，加入RIPA裂解緩沖液進行處理，提取細胞中總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。根據不同濃度進行定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后采用濕轉方法將蛋白轉至PVDF膜上，5% BSA室溫下封閉1 h。滴加一抗(稀釋比例為1∶1 000)，4℃孵育過夜。經TBST徹底洗去未結合的一抗后再常溫下孵育二抗(稀釋比例為1∶5 000)1 h，經TBST充分洗膜后，加入ECL顯影液完成顯色，化學發光儀拍照記錄。采用Image J進行蛋白定量分析，以各蛋白的灰度值與內參GAPDH的灰度比值進行蛋白定量分析。實驗重復三次。

1.5 細胞遷移和侵襲分析

選取8 μm孔徑的24孔Transwell小室評估乳腺癌細胞的侵襲和遷移能力。預先在Transwell小室的底部加入200 μL Matrigel與無血清培養液的混合物并平鋪于小室上層(按照1∶4稀釋)，置于37℃孵箱孵育1 h以使其充分凝固。將敲除FSIP1的MDA-MB-231和SK-BR-3細胞系及對應的陰性對照組細胞消化后離心棄去培養液，使用無血清培養基重懸，并調整細胞密度至1×105/mL。頂部小室加入200 μL細胞懸液，在小室下槽加入600 μL含有10%血清的培養基，于37℃下孵育24 h 后，擦除小室上層未穿過膜的細胞，將底部小室中的細胞用甲醇固定、結晶紫染色，并用顯微鏡進行定量分析。實驗重復三次。

1.6 統計分析

使用GraphPad Prism 7軟件進行統計分析。計量資料數據采用均數±標準差表示，數據滿足正態分布，且方差齊，組間比較使用配對t檢驗及單因素方差分析；FSIP表達與各臨床病理參數的關系使用卡方檢驗進行分析；生存曲線用Kaplan-Meier方法繪制，生存曲線的比較通過Log-rank檢驗進行；OS的影響因素分析采用Cox比例風險回歸模型，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FSIP1在乳腺癌細胞系和乳腺癌組織中的表達情況

與HMECs(MCF-10A)相比，各乳腺癌細胞系中FSIP1蛋白的表達水平均顯著升高(P<0.01)(圖1A，B)。此外，采用免疫組化法對6對乳腺癌組織及其癌旁組織中FSIP1的表達情況進行檢測，結果表明乳腺癌組織中FSIP1的表達水平明顯高于癌旁正常組織(P<0.01)(圖1C，D)。

圖1 FSIP1在乳腺癌細胞系和癌旁正常組織中的表達情況Figure 1 The over-expression of FSIP1 protein in breast tumor tissues and breast cancer cell linesNote：A-B.The expression of FSIP1 in breast cancer cell lines and normal cell line was detected by Western blot；C-D.The expression of FSIP1 in 6 pairs of breast cancer and adjacent non-cancerous tissues was detected by IHC.**P<0.01，compared with the HMECs or paratumor tissue.

2.2 FSIP1過表達與患者OS的關系

與FSIP1低表達乳腺癌患者相比，FSIP1高表達乳腺癌患者OS顯著縮短(中位OS：73個月vs.82個月，P<0.001)(圖2)。通過多因素Cox回歸將FSIP1與患者年齡、TNM分期納入回歸分析中，結果顯示FSIP1高表達可作為OS的獨立危險因素(HR=2.39，95%CI：1.88～3.05，P<0.001)。

圖2 在乳腺癌患者中FSIP1高表達與腫瘤惡性程度和較短的總生存期有關Figure 2 The high expression of FSIP1 protein was correlated with shorter overall survival of breast cancer patients

分析乳腺癌患者腫瘤組織中FSIP1表達水平是否與患者臨床疾病分期的有關，結果顯示FSIP1高表達與乳腺癌患者臨床分期較高有關(表1)(P<0.001)，同時FSIP1高表達與細胞增殖標記物Ki-67高表達有關(P<0.001)(表1)。

表1 乳腺癌患者FSIP1表達與臨床特征的關系[n(%)]Table 1 Basic information scale for patients[n(%)]

2.3 FSIP1對乳腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響

為了進一步闡明FSIP1的致癌功能，Western blot結果顯示敲除FSIP1基因后乳腺癌細胞系MDA-MB-231和SK-BR-3中FSIP1蛋白表達顯著降低(P<0.01)(圖3A)。

細胞遷移和侵襲實驗結果顯示，敲除FSIP1基因后乳腺癌細胞系MDA-MB-231和SK-BR-3的遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.01)(圖3B-3D)。

圖3 敲除FSIP1基因對乳腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響Figure 3 The FSIP1 gene knockout attenuated capabilities of migration and invasion in cancer cellsNote：A.The FSIP1 gene knockout was confirmed in MDA-MB-231 cells and SKBR3 cells by Western blot；B.The results of cell migration and invasion in MDA-MB-231 cells and SKBR3 cells；C and D.The results of statistical analysis for cell migration and invasion in MDA-MB-231 cells and SKBR3 cells.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(n=3).

3 討論

目前對于中晚期以及復發轉移型乳腺癌仍然缺乏有效的治療手段[11]，深入探究乳腺癌的致病機理以及對應的分子生物學機制，對于提高晚期乳腺癌患者的生存率至關重要[12-13]。FSIP1是最初在酵母雙雜交篩選中發現并鑒定的一種腫瘤睪丸抗原，其表達傾向于睪丸組織并在腫瘤細胞中重新激活并賦予細胞有絲分裂穩健性[14]。研究表明，FSIP1在乳腺癌細胞中高表達，并且能夠調節乳腺癌細胞自噬[15]，通過促進自噬增強了對多西他賽等化療藥物的敏感性[16]。FSIP1可直接結合HER2胞內結構域以促進乳腺癌進展[8]。然而，目前對于FSIP1在乳腺癌中的作用機制仍不完全清楚，其在乳腺癌中的生物學作用及影響仍有待進一步的研究與探討。

在本研究中，通過免疫組化及Western blot實驗檢測發現乳腺癌組織及細胞中的FSIP1顯著高表達。為探究FSIP1高、低表達是否與乳腺癌患者臨床病理特征有關，對404例既往就診于我院的乳腺癌患者組織切片中FSIP1的表達水平進行檢測并回顧性分析患者的病例資料，結果顯示晚期乳腺癌患者的FSIP1表達水平明顯較高，并且高表達FSIP1的乳腺癌患者常伴隨較短的OS。同時也驗證了FSIP1高表達與細胞增殖標志物Ki-67的陽性率相關。以上結果表明，FSIP1在乳腺癌組織及細胞中高表達，并且與乳腺癌患者的不良預后密切相關。

細胞的癌變及惡性轉化是一個多步驟的過程。乳腺癌干細胞驅動乳腺癌的原始致癌性、局部侵襲和遷移傾向，并且具有自我更新、多向分化和增殖潛能[17]。乳腺癌細胞需要重新編程能量代謝，對生長抑制信號不敏感，不受限制的生長信號，無限的復制潛能，細胞凋亡，逃避免疫檢測，組織侵襲和轉移以及持續的血管生成，共同促進了細胞的癌變及進展過程[18-20]。為進一步探究FSIP1在乳腺癌中的生物學功能，本研究采用基于CRISPR/CAS9的慢病毒技術敲除兩個具有高內源性FSIP1表達的乳腺癌細胞系MDA-MB-231和SK-BR-3細胞中的FSIP1基因，并通過Western blot實驗對敲除結果進行驗證。通過遷移實驗和侵襲實驗進一步證實，敲除FSIP1的乳腺癌細胞其遷移和侵襲能力明顯低于對照組。這些實驗充分說明了敲除FSIP1基因能夠顯著降低乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，從而證明FSIP1基因在促進乳腺癌的發生發展中起到關鍵作用。

綜上所述，本研究通過實驗發現了FSIP1是乳腺癌潛在的促癌基因，其在乳腺癌組織中表達顯著高于癌旁組織，并且與乳腺癌患者惡性程度相關，導致患者不良預后。有望成為評估乳腺癌患者預后的獨立生物標志物以及乳腺癌治療中潛在的分子靶點。乳腺癌的治療任重而道遠，我們需要更為深入地探究乳腺癌發生發展的生物學機制并為開展針對乳腺癌靶向治療的新藥研究奠定理論基礎，從而為乳腺癌的治療提供新策略。