豬肉中4種硝基呋喃類藥物的納米纖維固相萃取快速前處理及檢測方法的建立

陳雅南，衛蘭蘭，，邵棟梁，王 迪，楊燕燕，朱帥杰，李景軍*，

(1．安徽科技學院 食品工程學院，安徽 滁州239000；2．安徽國科檢測科技有限公司，安徽 合肥230000)

0 引言

硝基呋喃類藥物是一類人工合成的抗生素，主要通過微生物酶系統，抑制乙酰輔酶A，干擾微生物糖類的代謝，從而起抑菌作用[1]．這類藥物主要包括呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮，如圖1所示．硝基呋喃類藥物因為價格便宜，而且效果顯著，而廣泛應用于畜禽及水產養殖業，以治療由大腸桿菌或沙門氏菌引起的腸炎、疥瘡、赤鰭病等[2]．隨著硝基呋喃類藥物使用量的增加，這類藥物及其代謝物對人體有致癌、致畸胎的副作用也越來越顯著[3]．因此，2010年3月22日，呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮被中國衛生部列入可能違法添加的非食用物質黑名單[4-5]．

圖1 四種硝基呋喃類藥物的分子結構式

近年來，國內外對動物源性食品中獸藥殘留檢測的報道有很多．其檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[6]、液質聯用法(LC-MS)[7]、超高效液相色譜法(UPLC)[8]和酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)[9]等，這些方法存在使用成本高；普及率低，且對樣品前處理要求苛刻；存在交叉反應、容易出現假陽性等問題．動物源性食品基質復雜，目標物質含量極低，必須對樣品進行預處理才能進行檢測分析．納米纖維固相萃取(Packed-fiber Solid-phase Extraction，PFSPE)是一項能夠解決樣品基質復雜的前處理技術，現在也是分析化學的發展前沿和熱點．PFSPE是一種樣品前處理方法，由液-固萃取柱和色譜技術相結合發展而來，主要用于樣品分離、純化和濃縮，回收率高，能有效將目標物與干擾物質分離，操作簡便且省時省力．因為聚吡咯易于合成且具有良好的穩定性，所以在商業領域研究非常有前景．

本實驗基于功能性納米纖維研究利用高效液相色譜-紫外法對豬肉中4種硝基呋喃類藥物進行檢測，建立了簡便低耗且高效的檢測方法．該實驗采用納米纖維固相萃取樣品前處理技術，此方法不僅操作簡便高效，而且萃取柱的纖維填充量為幾微克，實用性強，為動物源性食品中獸藥殘留的分離檢測提供新的思路和途徑．

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

新鮮豬肉：鳳陽農貿市場購買；聚吡咯納米纖維：蘇州東奇生物科技有限公司提供．

乙酸銨：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鈉：分析純，天津市永大化學試劑有限公司；N，N-二甲基甲酰胺：99%生物技術級，上海麥克林生化科技有限公司；濃硫酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司．

硝基呋喃類標準品：呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮，純度均≥98%，上海賢鼎生物科技有限公司．

1．2 實驗儀器

日本島津LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；KQ3200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Vortex-M旋渦混勻儀，上海滬析實業有限公司；DHG-9030A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海三發科學儀器有限公司；梅特勒XS105DU型電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；FD．JH．JS 1000 mL超濾裝置、AP-01P真空泵，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；TGL-16臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司．

1．3 實驗方法

1．3．1 標準溶液的制備

(1)單標標準溶液的制備(1．0 mg/mL)

分別精確稱取4種硝基呋喃類藥物各10．0 mg(精確到0．01 mg)于10 mL容量瓶，用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解并用甲醇定容至刻度線處，4 ℃避光保存1個月．

(2)混標標準溶液1的制備(0．025 mg/mL)

先將4個單標標準溶液(1．0 mg/mL)用蒸餾水稀釋10倍，得到溶液濃度為0．1 mg/mL；再各取1 mL 0．1 mg/mL 4個單標標準溶液混合均勻，此時得到混標標準溶液1的濃度為0．025 mg/mL，4 ℃避光保存1個月．

(3)混標標準溶液2的制備(以SEM濃度標記)

精確稱取AHD、AOZ、AMOZ各10．0 mg(精確到0．01 mg)，SEM為0．5 mg(精確到0．01 mg)，分別于4個10 mL容量瓶中，用DMF溶解并用甲醇定容至刻度線處，此時AHD、AOZ、AMOZ濃度為1 mg/mL，SEM濃度為0．05 mg/mL．再各取1 mL混合均勻，此時得到混標標準溶液2的濃度為0．012 5 mg/mL(以SEM濃度標記)，4 ℃避光保存1個月．

1．3．2 納米纖維固相萃取柱的制備

納米纖維固相萃取柱和聚吡咯(PPy)納米纖維均購自蘇州東奇生物科技有限公司(如圖2所示)．稱取PPy納米纖維4．0 mg分次裝于萃取柱中，用直徑為0．5 mm的不銹鋼細棒壓實，即納米纖維固相萃取柱制備完成．需注意在使用納米纖維固相萃取柱之前，應先活化PPy納米纖維，即用200 μL甲醇洗滌后，再加入200 μL蒸餾水完成活化．

1．3．3 樣品前處理和萃取

新鮮豬肉購自當地農貿市場．稱取2．0 g(精確至0．01 g)試樣于50 mL塑料離心管中，加入20 mL 90%甲醇水，用勻漿機將其粉碎均勻1 min；混勻后超聲30 min，9 000 r/min冷凍離心10 min，移取其全部上清液，4 ℃保存備用．

圖2 PFSPE萃取柱裝置

先將待測樣柱上液移500 μL至納米纖維固相萃取柱中，再手動操作納米纖維固相萃取柱，利用空氣加壓，使待測樣緩慢流過納米纖維，然后液滴逐滴被壓出，1滴/秒的流速最合適[10]；然后再用100 μL洗脫劑把目標物從吸附劑上洗脫下來；洗脫后，將收集的洗脫液渦旋混勻1 min；最后，取一定量洗脫液進行高效液相色譜檢測分析，萃取裝置見圖2．特別注意的是在整個萃取的過程中，需仔細控制待測樣品以緩慢且均勻的流速流過PFSPE萃取柱(流速過快，萃取不完全；流速過慢，萃取住堵塞，致使待測樣品滯留在PFSPE萃取柱中)．

1．3．4 色譜條件

色譜柱：紫外檢測器(UV)，C18柱，柱150 nm，內徑4．6 nm；流動相：A：純甲醇，B：0．1%乙酸銨(梯度洗脫)見表1；流速：1．0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：10．0 μL；檢測波長：365 nm；運行時間：30 min(目標物保留時間)見表2．

表1 UPLC-UV流動相梯度洗脫程序

表2 硝基呋喃類藥物目標物保留時間

1．3．5 洗脫率計算

以0．025 mg/mL混標標準溶液1為柱上液，取其500 μL過納米纖維固相萃取柱，過柱后，移取適量的洗脫液對目標物進行洗脫，洗脫液混勻，洗脫液全部裝進自動進樣瓶中，供HPLC檢測分析，進樣體積為10 μL，記錄峰面積為Ai，同時以硝基呋喃類藥物0．025 mg/mL的柱上液，即混標標準溶液直接進樣分析的色譜峰面積記為As，以該公式(1)計算各納米纖維固相萃取條件下硝基呋喃類藥物的洗脫率，重復操作3次，計算其平均值，即最終洗脫率(%)[11]．

洗脫液=(Ai/5)/As

(1)

1．4 數據處理

本實驗所有液相數據采用Origin2019b(美國OriginLab公司)和Excel2019(美國Microsoft微軟公司)進行統計分析．

2 結果與分析

2．1 納米纖維固相萃取條件的優化

為得到最高的萃取效率，對影響PPy納米纖維萃取效率的主要因素：洗脫液的體積、洗脫液中硫酸的含量、纖維填充物的用量、柱子重復使用次數、鹽濃度對吸附條件的影響進行優化實驗．以0．025 mg/mL混標標準溶液1稀釋25倍，即0．001 mg/mL為柱上液，以洗脫率作為萃取效率的監測指標．

2．1．1 洗脫液體積的優化

硝基呋喃類藥物是一類含氧的五元雜環，如圖1所示，難溶于水，易溶于有機溶劑．實驗以甲醇為流動相，由于硝基呋喃類藥物易溶于甲醇，且聚吡咯納米纖維難溶于甲醇，不會影響洗脫效果，所以實驗選擇用純甲醇洗脫納米纖維小柱上吸附的目標物．洗脫液體積分別以40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL、200 μL進行優化實驗[11]．洗脫液體積與硝基呋喃類藥物洗脫率的關系如圖3所示．

圖3 洗脫液體積對硝基呋喃類藥物洗脫率的影響(n=3)

由圖3可知，隨著洗脫液體積的增加，洗脫率總體趨勢是先增大后減?。斚疵撘旱捏w積為100 μL時，可將納米纖維小柱上吸附的目標物有效地洗脫，此時洗脫率最佳．繼續增加洗脫液的體積，洗脫率呈現逐漸下降趨勢．因此，通過實驗確定洗脫液的體積為100 μL．

2．1．2 洗脫液中硫酸含量的優化

實驗發現，純甲醇溶液不能將硝基呋喃類藥物完全洗脫，100 μL純甲醇的洗脫率平均僅50%左右．硝基呋喃類藥物屬于強極性有機物，能夠與PPy納米纖維產生強烈的相互作用，其作用可能是由于PPy本身的陰離子交換性能以及PPy與目標物之間的π-π鍵作用引起的．有研究發現[12-14]，甲醇比水的極性弱，但也具有羥基可以與極性目標物競爭吸附劑上吸附位點，進而將目標物從固相吸附材料上洗脫下來．對于硝基呋喃來說，純甲醇洗脫率低，推斷是其分子中含σ鍵與π鍵，在pH=7條件下以離子形式與PPy的作用很強，致使純甲醇不能完全洗脫目標物．但其在酸性條件下能夠以分子形式存在，與PPy納米纖維相互作用反而減弱了，因此，在純甲醇溶液中加入硫酸，補充H+，從而使PPy納米纖維上的目標物洗脫下來．

結合實驗以及參閱文獻[15-16]得知，洗脫溶劑應有較強的洗脫能力，且應滿足UPLC-UV檢測的條件．研究不同比例的8 mol/L硫酸-甲醇混合溶液對吸附在納米纖維上的目標物進行洗脫，并對其洗脫效率進行考察．因此，選擇8 mol/L硫酸在洗脫液中含量為0%、10%、15%、20%進行優化實驗．洗脫液中硫酸含量與硝基呋喃類藥物洗脫率的關系如圖4所示．

圖4 洗脫液中硫酸含量對硝基呋喃類藥物洗脫率的影響(n=3)

由圖4可知，隨著8 mol/L硫酸含量的增加，洗脫率先增加后減?。? mol/L硫酸在洗脫液中含量為15%時，洗脫率最大．當硫酸含量過大，H+補充過多，甲醇中的羥基全部轉化為分子形式，致使洗脫率降低．故選擇8 mol/L硫酸在洗脫液中含量為15%，即在后續實驗中洗脫液為8 mol/L硫酸-甲醇(15∶85)混合溶液．

2．1．3 纖維填充物用量的優化

PPy納米纖維的填充量也是決定能否為目標物提供充足吸附位點的一個重要因素，以實現良好的富集．一般來說，吸附劑的用量應足夠大，萃取更多的目標物，為了確定納纖維填充物的用量，對不同用量的纖維填充物進行了優化實驗．本實驗研究了纖維填充物用量為3～8 mg質量范圍內的PPy納米纖維對4種硝基呋喃類藥物的萃取效果．纖維填充物用量與硝基呋喃類藥物洗脫率的關系如圖5所示．

圖5 纖維填充物用量對硝基呋喃類藥物洗脫率的影響(n=3)

由圖5可知，當納米纖維材料從3 mg增加到4 mg時，隨著纖維填充物用量的增加，4種目標物的洗脫率也隨之增加；當纖維填充物用量由5 mg增加至8 mg時，4種目標物的洗脫率隨著纖維填充物用量的增加而減?。渲饕蚴钱斃w維填充物用量逐漸增加時，柱床增大，100 μL洗脫液不能完全將目標物洗脫，導致洗脫效率降低；纖維填充物用量為7 mg和8 mg時，AHD、SEM、AOZ洗脫率急劇下降，也正說明了此原因．因此，本實驗選擇納米纖維用量為4 mg，進行后續實驗的納米纖維固相萃?。?/p>

2．1．4 柱子重復使用次數

在優化的納米纖維固相萃取條件下，對PPy納米纖維固相萃取柱的重復利用性能進行考察[17]．在PPy納米纖維固相萃取柱使用一次之后，用8 mol/L硫酸-甲醇(15∶85)混合溶液繼續洗脫，直到洗脫液中檢測不出目標物為止，實驗結果顯示洗滌3次之后再無目標峰出現．重復使用同一個PPy納米纖維固相萃取柱，進行4次相同實驗，考察其洗脫率的變化．柱子重復使用次數與硝基呋喃類藥物洗脫率的關系如圖6所示．

圖6 柱子重復使用次數對硝基呋喃類藥物洗脫率的影響(n=3)

由圖6可知，PPy納米纖維固相萃取柱最多重復使用2次．PPy納米纖維固相萃取柱在重復使用2次之后，洗脫率明顯下降，表明其化學和機械穩定性一般，但總體來說，其良好的重復使用性能與高效、低耗、綠色環保等特點，使其具有很好的實際應用價值．

2．1．5 鹽濃度對吸附條件影響的優化

由于流動相B泵使用的是0．1%乙酸銨溶液，乙酸銨是一種有機化合物，結構簡式為CH3COONH4，乙酸銨水溶液pH在7左右，顯中性，屬于鹽類．因此，本實驗研究鹽濃度對吸附條件的影響．結合相關文獻，認為NaCl穩定性比較好，其水溶液也呈中性，所以實驗將氯化鈉加入待檢測樣品中，研究鹽濃度對目標物洗脫率的影響，分別用0．12、0．15、0．18、0．20、0．23和0．26 g/mL NaCl溶液稀釋目標物混標標準溶液1至目標濃度，再進行納米纖維固相萃?。煌}濃度與硝基呋喃類藥物洗脫率的關系如圖7所示．

圖7 不同鹽濃度對硝基呋喃類藥物洗脫率的影響(n=3)

由圖7可知，隨著NaCl溶液濃度的增加，洗脫率先增加后降低，呈倒“U”型．因為NaCl濃度不斷增大，水溶液的粘度增大，分子間傳遞受阻，從而導致洗脫率降低；加入NaCl溶液濃度過高，會使目標物與吸附劑表面的相互作用減弱，洗脫率降低．因此，在本實驗中研究不同鹽濃度與硝基呋喃類藥物洗脫率的關系時，可以適當添加NaCl溶液，實驗研究表明添加的NaCl溶液最佳濃度為0．18 g/mL，目標分子的富集效果最顯著．

2．2 方法學研究

首先驗證了標準溶液和混合基質標準溶液的方法，并對本實驗進行了方法學評價，包括線性、檢出限(LOD)、定量限(LOQ)、回收率及精密度．首先要測定樣品基體中4種硝基呋喃類藥物的含量，作為本底值，方法學驗證中均扣除了各目標物的本底值．

2．2．1 回收率與精密度

以4種硝基呋喃類藥物混標標準溶液2做添加回收實驗，添加濃度分別為50 ng/mL、100 ng/mL、250 ng/mL，每個濃度平行3次[18]．然后按上述方法萃取洗脫后進行HPLC檢測．計算其回收率和日內(早、中、晚各測定1次)與日間(連續測定3 d)精密度．該方法的檢出限與定量限用信噪比(S/N)為3和10的濃度確定，實驗結果如表3所示，4種目標物的LOD和LOQ在2．26～7．18 ng/mL和7．53～23．94 ng/mL的范圍；各個添加濃度的回收率范圍為70．65%～84．32%；RSD日間(n=3)在5．41%～16．95%之間，RSD日間(n=3)為2．80%～14．21%，表現出良好的準確度和精密度．

表3 4種硝基呋喃類藥物的線性范圍、LOD、LOQ、回收率與精密度

2．2．2 加標實驗的回收率與精密度

將4種硝基呋喃類藥物混標標準溶液2注射到2．0 g陰性試樣中，再進行樣品前處理．最終定容濃度為：50 ng/mL、100 ng/mL、250 ng/mL，做這3個濃度的添加回收實驗，進行方法精密度和準確度的考察．然后按上述方法萃取洗脫后進行HPLC檢測．該方法的檢出限與定量限用信噪比(S/N)為3和10的濃度確定，結果如表4所示，4種目標物的LOD和LOQ分別在2．07～7．17 ng/mL與6．91～23．90 ng/mL的范圍．4種目標物的加標回收率為70．23%～94．42%，RSD日間(n=3)在2．56%～11．95%之間，RSD日間(n=3)為3．50%～15．10%，表現出良好的準確度和精密度．

表4 4種加標硝基呋喃類藥物的線性范圍、LOD、LOQ、回收率與精密度

2．2．3 本方法與其他測定方法比較

將該方法在樣品萃取方法、檢測方法、處理時間(衍生化)、回收率、LOD與LOQ以及線性范圍等方面與國家標準(GB/T 21311)、文獻報道的方法進行比較．由實驗結果可知，本方法僅需4．0 mg PPy納米纖維和100 μL洗脫劑便可得到最佳的方法檢出限(2．07～7．17 ng/mL)以及良好的加標回收率(70．23%～94．42%，RSD < 15．10%，n=3)，方法簡便低耗且高效，在23．0 min內可完成4個樣品的同時處理，且本方法使用的儀器設備要求相對于其他方法使用的儀器設備要求較低．由表5可知，除了本實驗方法外，其他方法都需要衍生化處理，時間較長，而且衍生化方法使用不當會損壞色譜柱、某些衍生化試劑需氮氣吹干、衍生化不完全，影響靈敏度等以及衍生化試劑不當，產物分子量過大，影響實驗結果．

表5 本方法與文獻報道豬肉中硝基呋喃類檢測方法比較

2．3 硝基呋喃類藥物的色譜圖

參考相關文獻[27-34]，并通過實驗確定流動相與流動相梯度洗脫程序(見表1)，在該緩沖體系下，如圖8所示，4種硝基呋喃類藥物的峰形較好，雜峰對主峰的干擾減少，目標峰和雜質峰能夠完全分離，有利于HPLC-UV對樣品進行檢測分析．

圖中(a)(c)：①呋喃妥因；②呋喃西林；③呋喃唑酮；④呋喃它酮圖8 硝基呋喃類藥物柱上液(a)、柱下液(b)及洗脫液(c)的色譜圖

3 結論與討論

本實驗使用的材料是PPy納米纖維，相比國家標準、文獻報道的方法不僅操作簡單方便、化學試劑用量少、成本較低；而且由于PFSPE的填料使用量少，此實驗僅需4 mg；8 mol/L硫酸-甲醇(15∶85)混合溶液作為洗脫液時，使用量僅為100 μL，大大減少了對人體和環境的傷害；基質中適當添加NaCl溶液，可以提高洗脫效率，其最佳濃度為0．18 g/mL；PPy納米纖維固相萃取柱可重復使用2次，低耗、綠色環保，使其具有很好的實際應用價值．此外，該方法前處理不需衍生化和氮氣吹干就能實現濃縮樣品，大大縮短了前處理的時間，且儀器設備要求相對于較低．

本實驗對萃取條件進行選擇和優化，建立了豬肉中硝基呋喃類藥物的納米纖維固相萃取-高效液相色譜測定方法．應用納米纖維固相萃取柱對樣品進行凈化提取，有效地減少了基體中其他成分對目標物的干擾，提高了靈敏度，回收率高，重現性較好．結果表明，該方法更加簡便、高效、低耗、綠色，結果準確可靠，有機溶劑用量少，適用于豬肉中硝基呋喃類藥物的檢測．