抗酸染色、Xpert MTB/RIF 與T-SPOT.TB 聯合檢測在結核病診斷中的應用價值

羅 倩 劉澤遠 劉 陳 娟 童堯堯 任凌霜 伍仕敏

1長江航運總醫院檢驗科 湖北 武漢 430014；2武漢大學公共衛生學院 湖北 武漢 430071；3武漢市金銀潭醫院檢驗科 湖北 武漢 430032；4武漢市臨床檢驗中心 湖北 武漢 430030

結核?。╰uberculosis，TB）作為一種以呼吸道傳播為主的慢性傳染病，嚴重威脅著人類健康，是當前全球重要的公共衛生問題之一［1］。據世界衛生組織（WHO）發布的《2020 年全球結核病報告》統計，2019 年全球估計新增結核病患者約1 000 萬例，實際報告新確診結核病例為710 萬，約44%的新發病例分布在東南亞地區，中國占比約為8.4%，僅次于印度（26%）和印度尼西亞（8.5%），位列第3［2］。

臨床統計數據顯示，結核病的治療成功率約為85%［3］，及時準確的診斷和治療不僅有助于減少結核病死亡結局的發生，還可以進一步減少結核病的傳播。因此，結核病的早期診斷對于結核病防治具有十分重要的意義。傳統的結核病診斷“金標準”是結核菌培養，但是由于傳統的固體培養檢測時間較長，液體培養所需設備昂貴，且靈敏度相對較低［4］，無法滿足臨床對結核病診斷的需求。目前，臨床常用的結核病實驗室診斷技術主要包括抗酸染色、培養、巢式實時熒光PCR 法（Xpert MTB/RIF）和結核感染T 細胞斑點試驗（tuberculosis infection T cell spot test，T-SPOT.TB）等方法，后兩種診斷方法的使用可以大大縮短檢測時間。

本研究通過回顧分析確診結核病患者、臨床診斷結核病患者和健康體檢者抗酸染色、Xpert MTB/RIF 和T-SPOT.TB 實驗室檢測結果，從而研究抗酸染色、Xpert MTB/RIF 或T-SPOT.TB 單獨或聯合檢測在結核病診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1研究對象 回顧分析2017 年1 月至2019 年12 月在武漢市金銀潭醫院檢驗科進行抗酸染色涂片、Xpert MTB/RIF 或T-SPOT.TB 檢 查 的19 410例患者和45 例健康體檢者的檢查結果，結合病例資料進行研究。

1.1.2納入排除標準 納入標準：2017 年1 月至2019 年12 月在武漢市金銀潭醫院檢驗科接受結核病相關實驗室檢查的患者和健康體檢者。結核病診斷依據《肺結核診斷標準（WS288-2017）》和中華醫學會《臨床診療指南—結核病分冊》，以病原學檢查為主，同時結合患者的流行病學史、臨床表現、影像學檢查、及其他輔助檢查進行綜合分析。

排除標準：①診斷不明或臨床診斷為非肺結核病患者。②就診時年齡小于18 周歲的患者。③人類免疫缺陷病毒（HIV）抗體檢測陽性患者。排除原因：由于嬰幼兒和艾滋病患者的免疫系統功能不健全，導致這兩類人群在接受T-SPOT.TB 檢測時相較于一般結核病人群靈敏度較低。資料的收集遵循知情同意原則。

1.1.3分組情況 排除其中診斷不明確或臨床診斷為非肺結核病患者8 014 例，排除就診年齡小于18 歲患者974 例和HIV 抗體檢測陽性患者499 例，最終納入研究的人數為9 968 例。其中，有明確細菌學證據（結核培養陽性）的確診結核病組患者1 299 例（包括肺內結核和肺外結核；男性患者969例，女性患者330 例），臨床診斷肺結核組患者8 624例（男性患者5 872 例，女性患者2 752 例），健康對照組45 例（男性27 例，女性18 例）。

1.2 方法

1.2.1儀器與試劑 BHC-ⅡB2 二級生物安全柜（型號：蘇州安泰空氣技術有限公司），顯微鏡（型號：CX21，日本OLYMPUS 公司），抗酸染色液（珠海貝索生物科技有限公司），GeneXpert MTB/RIF 儀器及相應試劑盒（美國Cepheid 公司），T-SPOT.TB 檢測試劑（英國Oxford Immuno-tec 公司）。

1.2.2檢測方法

1.2.2.1抗酸染色 用接種環挑取痰液中干酪樣壞死小塊或帶血小塊，制成厚涂片，烘箱干燥15 min后取出染色架，放置于水槽上。趁玻片發燙時滴加石炭酸復紅染液蓋滿痰膜，保持染色5 min（染色期間應始終保持痰膜被染色液覆蓋，必要時可續加染色液）。然后，用流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去染色液，瀝去標本上剩余的水。自痰膜上端外緣滴加3%鹽酸乙醇蓋滿玻片，脫色1 min（如有必要，流水洗去脫色液后，再次脫色至痰膜無可視紅色為止）。用流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去脫色液，瀝去玻片上剩余的水。滴加亞甲藍復染液，染色30 s 后，用流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去復染液，然后瀝去標本上剩余的水。待玻片干燥后置油鏡下觀察：未脫色細菌呈紅色為抗酸性細菌，脫色經復染呈藍色的細菌為非抗酸性細菌。

1.2.2.2Xpert MTB/RIF 采取膜過濾法提取核酸，通過超聲破碎細胞，然后通過濾膜來分離蛋白和核酸。視不同樣本情況先進行前處理，如痰樣本過于黏稠，可先加入適量4% NaOH，震蕩混勻后靜置15～20 min，待樣本充分液化后進行操作。組織樣本需先加入少量生理鹽水后研磨，至肉眼見樣本為均勻懸液樣，再進行操作取待測樣本約0.5 mL 加入試劑盒提供樣本處理液1.5 mL 中，來回振搖10～20 次，使其充分混勻后，靜置15 min，取液化后樣品（盡量不含顆粒和塊狀物）1 mL 加入反應盒指定孔上機檢測（避免氣泡）。試驗結束后軟件可自動判讀結果，判斷待測樣本中是否檢出結核分枝桿菌復合群，如果檢出，同時判斷是否檢出Rif Resistance。當樣本中含有結核分枝桿菌復合群時，5 個目的片段分別擴增，儀器的GeneXpert Dx 系統會測量熒光信號和計算每根探針的Ct 值，得到一個半定量的結果。當5 支探針均為陽性的時候，即為檢出結核分枝桿菌復合群且對利福平敏感。如果這5 個目的片段有突變，就會有相應探針的擴增失敗，單根探針的結果為陰性，則提示檢出結核分枝桿菌復合群且對利福平耐藥。系統軟件同時設定探針中較低的Ct 值為模板起始濃度，如果某根探針擴增陽性，但Ct 值與起始濃度差大于系統設定范圍，也會被判定為利福平耐藥。當擴增產物濃度過低，系統計算值會處于灰區，出現耐藥不明確的結果。

1.2.2.3T-SPOT.TB 檢測 采集患者外周靜脈血，在室溫下進行運輸和保存，全程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。結果判定：如果抗原A 和/或抗原B 有應答，檢測結果為“有反應性”時，參照以下標準：空白對照孔斑點數為0～5 個時且（抗原A 或抗原B 孔的斑點數）-（空白對照孔斑點數）≥6；空白對照孔斑點數為6～10 個時且（抗原A 或抗原B孔的斑點數）≥2×（空白對照孔斑點數）。如果不符合上述標準且陽性質控對照孔正常時，檢測結果為“無反應性”。當陽性質控對照孔的結果為“不確定”且抗原A 和抗原B 孔的結果均為“無反應性”時，認為該實驗結果為“并不確定”，需進行復查。

1.3 觀察指標分別統計三種檢查方法單獨檢測，抗酸染色與GeneXpert MTB/RIF 或T-SPOT. TB聯合檢測的結核陽性檢出率，并比較其靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值等指標。

1.4 統計學處理使用Microsoft Excel 2019 建立數據庫，采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據統計，計數資料用例數（例）表示，計量資料用均數±標準差（±s）描 述，計 數 資 料 運 用χ2檢 驗 進 行 比 較，P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 人群一般資料納入的研究對象被分為確診結核病組（包括肺內結核和肺外結核）、臨床診斷肺結核組和健康對照組。確診結核病組共1 299 例患者，其中男性969 例，女性330 例，平均年齡為（47.82±18.46）歲；臨床診斷肺結核組共8 624 例患者，其中男性患者5 872 例，女性患者2 752 例，平均年齡為（47.08±17.77）歲；健康對照組共45 例，其中男性27 例，女性18 例，平均年齡為（38.01±13.54）歲。見表1。

表1 研究對象的一般資料

2.2 三種診斷方法單獨檢測結核病的陽性率的比較在確診結核病組中，抗酸染色、Xpert MTB/RIF 和T-SPOT. TB 檢測的陽性檢出率分別為62.4%（811/1 299）、86.7%（1 072/1 236）和98.0%（292/298），與抗酸染色相比，Xpert MTB/RIF 和T-SPOT. TB 檢測陽性率差異有統計學意義（χ2=195.7 和χ2=57.4，均P＜0.01）。臨床診斷肺結核組患者抗酸染色、Xpert MTB/RIF 和T-SPOT.TB 的陽性檢出率分別為16.2%（1 319/8 163）、59.7%（1 231/3 056）和74.8%（2 508/3 352），與 抗 酸 染 色 相 比，Xpert MTB/RIF 和T-SPOT. TB 檢測陽性率差異有統計學意義（χ2=736.7 和χ2=3 685.3，均為P＜0.01）。見表2。

表2 單項檢查結核陽性檢出率比較

2.3 抗酸染色和Xpert MTB/RIF 聯合檢測診斷效果比較在確診結核病組和健康對照組中，分別有1 236 和45 例患者接受了抗酸染色和Xpert MTB/RIF 檢測。如表3 所示，抗酸染色、Xpert MTB/RIF 檢測和聯合檢測的靈敏度分別為63.2%、86.7%和89.6%。聯合檢測的靈敏度與抗酸染色或Xpert MTB/RIF 單獨檢測相比，差異有統計 學 意 義（χ2=816.2 和χ2=5.0，P＜0.01 和P=0.025）?？顾崛旧蚗pert MTB/RIF 單項檢測靈敏度差異有統計學意義（χ2=182.5，P＜0.01），特異度差異無統計學意義?？顾崛旧蚗pert MTB/RIF 單項檢測或聯合檢測特異度均為100%。單項檢測或聯合檢測的陽性預測值差異無統計學意義，抗酸染色、Xpert MTB/RIF 檢測和聯合檢測的陰性預測值分別為9.0%、21.5% 和26.0%，Xpert MTB/RIF 單獨檢測或聯合檢測的陰性預測值與抗酸染色相比差異有統計學意義（χ2=20.9 和χ2=32.1，均P＜0.01）；抗酸染色、Xpert MTB/RIF檢測和聯合檢測的正確率分別為64.5%、87.2%和90.0%，Xpert MTB/RIF 單項檢測或聯合檢測的正確率與抗酸染色相比差異有統計學意義（χ2=180.4和χ2=237.4，均P＜0.01）。

表3 抗酸染色和Xpert MTB/RIF 聯合檢測診斷效果比較[%(n/N)]

2.4 抗酸染色和T-SPOT. TB 聯合檢測診斷效果比較在確診結核病組和健康對照組中，分別有298 和45 例患者接受了抗酸染色和T-SPOT.TB 檢測。如表4 所示，抗酸染色、T-SPOT.TB 檢測和聯合檢測的靈敏度分別為58.7%、98.0%和98.7%?？顾崛旧?、T-SPOT.TB 檢測和聯合檢測的特異度分別為100%、84.4%和84.4%。聯合檢測的靈敏度、特異度與抗酸染色相比差異均有統計學意義（χ2=141.7 和χ2=5.6，P＜0.01 和P=0.018），與T-SPOT. TB 單獨檢測相比差異無統計學意義。T-SPOT.TB 單項檢測的靈敏度、特異度與抗酸染色相比差異均有統計學意義（χ2=135.4 和χ2=5.6，P＜0.01 和P=0.018），與T-SPOT. TB 單獨檢測相比差異無統計學意義。單項檢測或聯合檢測的陽性預測值差異無統計學意義，抗酸染色、T-SPOT. TB 和聯合檢測的陰性預測值分別為26.8%、86.4%和90.5%，T-SPOT. TB 單獨檢測或聯合檢測的陰性預測值與抗酸染色相比差異有統計學意義（χ2=52.0 和χ2=57.0，均P＜0.01）；抗酸染色、T-SPOT.TB 和聯合檢測的正確率分別為64.1%、96.2%和96.7%，T-SPOT. TB 單獨檢測或聯合檢測的正確率與抗酸染色相比差異有統計學意義（χ2=111.0 和χ2=116.3，均P＜0.01）。

表4 抗酸染色和T-SPOT.TB 聯合檢測診斷效能比較[%(n/N)]

2.5涂陰結核病患者 Xpert MTB/RIF 和T-SPOT. TB 檢出效果比較在確診結核病組中，有455 例涂陰結核病患者進行了Xpert MTB/RIF檢測，結果327 例檢測為陽性，128 例檢測為陰性，陽性率為71.6%（327/455）；有123 例涂陰結核病患者進行了T-SPOT.TB 檢測，結果為119 例檢測結果為陽性，4 例檢測結果為陰性，陽性率為96.7%?？ǚ綑z驗表明，兩種檢測方法對于涂陰的結核病患者靈敏度差異有統計學意義（χ2=34.0，P＜0.01），T-SPOT.TB 檢測靈敏度更高。

3 討論

我國作為全球30 個結核病高負擔國家之一，結核病防控形勢依然十分嚴峻，每年報告新發結核病患者約80 萬例，位居法定傳染病第2 位［5］。為實現我國《遏制結核病行動計劃（2019—2022 年）》中要求的到2022 年全國肺結核發病率降至55/10 萬以下，死亡率控制到3/10 萬以下的行動目標，必須加大篩查力度，最大限度發現患者?？顾崛旧桥R床最常用的一種結核病快速診斷方法，具有檢測時間短、操作簡單、價格低廉等優勢，但是其檢測靈敏度相對較低，通常情況下檢出率僅為30%～50%，假陰性的情況較多。因此，對于結核病患者特別對于多次涂陰的結核病患者亟需一種更加快捷的聯合檢測方法以提高診斷的靈敏度。

Xpert MTB/RIF 是由美國Cepheid 公司開發的，并獲得世界衛生組織推薦的結核病快速診斷技術，不僅具有較高的結核病診斷靈敏度和特異度［6］，同時還可以快速準確檢測出利福平耐藥基因（ropB突變基因），對臨床結核病的診斷和治療具有重要意義。除了一般成人肺結核病人外，Xpert MTB/RIF 檢測對于肺外結核患者［7］、兒童肺結核患者、艾滋病患者等特殊結核病患者同樣有著較好的檢出效果。T-SPOT.TB 試驗是基于γ 干擾素釋放實驗（TB-IGRA）原理，通過酶聯免疫斑點技術特異性檢測受試者體內結核效應T 細胞，從而達到診斷受試者是否感染結核桿菌的目的，具有早期、快速、價廉、生物安全性高和應用范圍廣等特點?，F有研究表明，其在結核病的診斷中同樣具有非常高的靈敏度和檢出率，對于兒童結核病患者其靈敏度和特異度分別為84.0%和99.1%［8］，對于合并HIV 感染的結核病患者其檢測靈敏度和特異度分別為83.7%和80.2%［9］。

本研究回顧分析了2017 年1 月至2019 年12 月在武漢市金銀潭醫院住院的19 410 例患者和45 例健康體檢者的抗酸染色、Xpert MTB/RIF 或T-SPOT.TB 的檢查結果，共有9 968 例患者納入研究，分為確診結核病組（包括肺內結核和肺外結核）、臨床診斷肺結核組和健康對照組。結果表明，在確診結核病組和臨床診斷肺結核組中，Xpert MTB/RIF 和T-SPOT. TB 檢測的陽性檢出率顯著高于抗酸染色；另外，確診結核病組抗酸染色、Xpert MTB/RIF 和T-SPOT.TB 檢測的陽性檢出率同樣顯著高于臨床診斷肺結核組和健康對照組。

進一步研究發現，Xpert MTB/RIF 檢測結核病的靈敏度和特異度分別為86.7%和100%，對涂陰的結核病患者陽性檢出率為71.6%，靈敏度略低于李秋平等［10］（92.1%）的報道，而對于涂陰的結核病患者陽性檢出率則高于楊健等［11］（61.0%）的報道。T-SPOT.TB 檢測結核病的靈敏度和特異度分別為98.0%和84.4%，對涂陰的結核病患者陽性檢出率為96.7%，靈敏度略高于黎永華等［4］（91.8%）的報道，與李曉和喬美芳［12］的研究報道的靈敏度（97.56%）持平，而對于涂陰的結核病患者陽性檢出率則高于Liu 等［13］（81.4%）的報道。

在分別使用三種方法單獨進行結核病診斷時，相較于抗酸染色，Xpert MTB/RIF 和T-SPOT.TB均具有較高的靈敏度，但T-SPOT.TB 檢測的特異度稍低。 在抗酸染色與Xpert MTB/RIF 或T-SPOT.TB 聯合檢測時，相較于單獨使用抗酸染色可有效提高檢測的靈敏度和檢出率。但是，聯合檢測的檢出效果相較于Xpert MTB/RIF 或T-SPOT.TB 單獨檢測提升并不明顯，主要是由于Xpert MTB/RIF 和T-SPOT. TB 診斷方法自身具有較高的靈敏度，在與抗酸染色聯合檢測時提升空間有限?？顾崛旧谂R床檢驗科應用廣泛，因此本研究結果顯示，通過對抗酸涂片陰性的疑似結核病患者進行Xpert MTB/RIF 或T-SPOT.TB 聯合檢測，可以在較低的檢測成本條件下獲得較好的檢出效果，對于經濟欠發達和醫療資源相對缺乏地區的結核病篩查具有重要意義。需要進一步指出的是，雖然本研究顯示，T-SPOT.TB 聯合痰涂片對結核病的輔助診斷更加提高診斷的靈敏度，因此T-SPOT.TB 檢測本身的陰性預測值較高，彌補了抗酸染色陽性預測值高而陰性預測值低的不足，二者聯合檢測更加能夠提升診斷效能。

同時，本研究也存在一定的局限：由于是回顧性研究，加上資料來源于傳染病醫院，可納入研究的健康對照組病例數相較于病例組較少，這些同期研究的健康人群多是本院職工的體檢結果。但由于本研究涉及的研究對象較多、時間跨度較大，并且數據來源于回顧分析，因此得出的結論會更加客觀、公正、科學，同時再一次證實前期本研究團隊對IGRA 的前瞻性研究結論［14］。

綜上所述，本研究結果表明：在結核病診斷中，抗酸染色作為常規檢測項目靈敏度較低，Xpert MTB/RIF 或T-SPOT. TB 檢測靈敏度明顯高 于 抗 酸 染 色。 采 用 Xpert MTB/RIF 或T-SPOT.TB 聯合抗酸染色均可顯著提高結核病診斷的靈敏度，特別是對于涂陰結核病患者，聯合T-SPOT.TB 檢測可顯著提高診斷效能。